尿液样本中游离DNA完整性分析

该方法的总体目标是评估尿液游离DNA在特定癌基因序列上的完整性。该方法有助于解答泌尿系统肿瘤领域的一些关键问题，例如膀胱癌和前列腺癌的早期无创诊断。该技术的主要优势在于操作简便且易于分析。

该技术的应用前景涉及泌尿系统恶性肿瘤的诊断，因为这类肿瘤通常会向尿液中释放细胞和游离核酸。尽管该方法可用于分析尿液样本，但也同样适用于其他体系，如血清或血浆。通常情况下，刚接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为尿液中游离DNA的浓度往往较低。

我们最初在尝试寻找一种用于膀胱癌无创早期检测的简便方法时，提出了本方法的构想。开始操作前，采集一份50毫升清洁中段晨尿样本，样本需在4°C下保存且保存时间不超过3小时。将样本轻轻颠倒混匀两次，随后将其均分为两份，分别加入两个50毫升的锥形离心管中。

在4°C条件下，以850 × g离心样品10分钟。然后，将每管上清液的上层10毫升转移至两个5毫升离心管中，每个管中至少保留2毫升上清液在沉淀之上。弃去沉淀，并将上清液在-80°C下保存。

根据需要对其他尿液样本重复此步骤。开始DNA纯化时，将每个样本的尿液上清液等分试样解冻。振荡解冻后的样本，并将试管倒置两次。

取一毫升样本加入五毫升离心管中，其余样本于负80摄氏度保存。根据生产商说明书，准备适用于尿液样本的DNA纯化试剂盒。向样本中加入100微升蛋白酶K和一毫升裂解缓冲液，用移液器充分混匀。

将样品在56摄氏度孵育15分钟。孵育期间，准备旋转柱中的洗涤缓冲液。孵育结束后，让样品冷却至室温，然后加入1毫升无水乙醇，并用移液器充分混匀。

将650微升样品转移至层析柱中。在6000 × g条件下离心1分钟。更换收集管，并重复此步骤，直至所有样品均加载至层析柱上。

然后加入500 µL第一种洗涤缓冲液，以6000 ×g离心柱子1分钟。更换收集管，加入500 µL第二种洗涤缓冲液，以最大速度离心柱子3分钟。将柱子放入一个新的干净收集管中，再次以最大速度离心3分钟，以去除残留的洗涤缓冲液。

将层析柱转移至一个新的1.5毫升微量离心管中。加入50微升洗脱缓冲液至层析柱中，静置7分钟使缓冲液充分浸润层析柱。随后在6000 × g条件下离心1分钟。

将洗脱液重新吸入柱中，以最大转速离心柱子一分钟，以获得尿液游离DNA。开始制备标准品时，首先使用纯化试剂盒从合适的细胞系中分离DNA。根据试剂盒制造商的说明，使用分光光度计对细胞系中每个纯化尿液样本的DNA进行定量。

将UCF DNA稀释至每微升一纳克，并将稀释后的样品在-20摄氏度保存，直至进行完整性检测。将细胞系DNA稀释，制备六份不同浓度的100微升标准品。将标准品在-20摄氏度保存。

开始DNA完整性检测时，将UCF DNA样本、标准品、适当的PCR引物以及绿色预混液置于冰上解冻。然后准备72孔转子盘和条状管，在各孔中分别加入两份10微升的标准品，随后加入每个样本。

准备两孔含有10微升无RNase水的孔作为阴性对照。对于每个加样孔，配制包含1微升每种引物、12.5微升绿色超混合液和6.5微升无RNase水的混合液。将15微升该混合液转移至每个加样孔中，然后将各孔转移至72孔转子盘中。

根据制造商的说明，使用实时仪器进行PCR反应。通过仪器配套软件，检查各重复样本的循环阈值差异是否达到或超过1。将差异达到或超过1的样本从分析中剔除，并计算剩余样本的中位循环阈值。

对每个循环阈值中位数为36或更低的样本进行熔解曲线分析，以评估PCR产物的特异性。然后利用标准曲线确定每个扩增子的浓度（单位为纳克/微升）。分离尿液游离DNA，并在四个在实体瘤中DNA拷贝数增加的区域评估DNA完整性。

还评估了对照序列，以确认每个样本中的DNA含量足以进行完整性检测。针对每个基因，计算了游离DNA的总浓度及其变异系数。该方法检测膀胱癌的敏感性为73%，特异性为84%；而检测前列腺癌的敏感性仅为58%，特异性为44%。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在一天的工作时间内完成。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如数字 PCR 或高通量测序，以回答更多科学问题，例如目标基因的拷贝数变化情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何以极为简便的方法从尿液中分离游离 DNA，以及如何利用实时 PCR 技术研究特定目标区域的完整性。