监测星形胶质细胞反应性与增殖 体外 在模拟缺血条件下

以下方案旨在展示如何从幼鼠脑组织中分离原代星形胶质细胞，以进行氧糖剥夺（OGD）实验。将纯化的星形胶质细胞暴露于氧糖缺乏的环境中，是一种可用于模拟缺血性脑卒中部分条件的实验模型。通过使用特异性星形胶质细胞标志物（如GFAP），可观察并测量细胞在经历氧糖剥夺后的系统性变化。

总之，这些在模拟缺血条件下暴露的分离细胞可用于测试缺氧条件下激活的新通路，以及具有抗缺血性脑卒中保护作用的其他药物。在本实验方案的这一部分，将从新生大鼠大脑皮层中分离星形胶质细胞。该操作的目的是获得原代星形胶质细胞培养物，以进行氧糖剥夺实验。

本实验所需的材料如下：在使用本实验方案前，所有材料均需进行高压灭菌。实验开始前，将生物安全柜暴露于紫外灯下至少20分钟。开始实验时，向每块培养板中加入三至五毫升完全DME培养基。

将按以下方式分割：一只小鼠脑组织一份，所有皮层组织两份，所有去除软脑膜的皮层组织三份。用70%乙醇消毒后，断头处死幼鼠。从头部后侧开始，沿中线向前至鼻部做一切口。

用弯头镊子去除颅骨，轻轻刮除小脑以暴露大脑皮层。用镊子取出暴露的脑组织，将脑放入含有培养基的第一只培养皿中。对所有其他幼鼠重复上述步骤。

用显微解剖镊的尖端沿中线裂隙轻轻分离大脑半球。用镊子以夹取动作去除白质和海马，从而剥离皮层并将其留在原处。将剥离的皮层转移至标记为2号的培养皿中。

对所有脑组织重复上述操作，将所有分离出的皮层合并置于培养皿中。轻轻摇晃培养皿，使培养基在所有皮层组织间均匀分布。使用解剖显微镜观察剥离后皮层表面的脑膜。

脑膜是一层非常薄且透明的结构，可通过寻找组织周围细小的红色毛细血管来识别。仔细检查并用精细镊子从每个大脑半球的两侧轻轻剥离覆盖在大脑皮层表面的脑膜，并将其移除。将清理干净的皮层组织放入新培养皿中，标记为3号。

使用胃部或搅拌器方法进行组织解离时，将培养皿中洁净的去皮皮层组织及培养基倒入无菌搅拌袋中。加入足量培养基，使搅拌袋内的总体积达到 5 毫升。将搅拌袋放入 stomacher 80 中，关闭门时留出约 2 厘米的袋体在门外可见。

该仪器中的细胞解离在高速下进行2.5分钟后完成。或者，也可通过关闭无菌袋，并在生物安全柜中用烧杯轻轻敲击组织，直至组织颗粒形成细小悬浮液来进行组织解离。注意在袋与烧杯之间垫上布巾，以避免摩擦导致袋子破裂。

将细胞悬液倒入60目筛网的中心。将过滤后的细胞加入100目筛网中央，静置使其依靠重力过滤。将过滤后的细胞悬液转移至15毫升锥形管中。

在离心机中以200 × g的离心力离心细胞悬液，建议使用水平转子，离心5分钟。弃去上清液，倒入烧杯中丢弃。向细胞沉淀中加入完全新鲜培养基。

使用血清学移液管在最多五毫升培养基中重悬并解离细胞团块。将所需量的细胞悬液加入培养瓶中，并补充培养基。将重悬的细胞团块加入含培养基的培养瓶中。

将细胞均匀分布于培养瓶中，并置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中。请记住每三天更换一次培养基。以下方法旨在可控环境中剥夺细胞的氧气和葡萄糖。

该模型的目的是研究星形胶质细胞在类似缺血性中风条件下的反应。本实验所用材料包括：通过连接气体系统的移液管对无葡萄糖培养基进行气体置换。使用混合气体以每分钟10至15升的流速向溶液中鼓泡10分钟。

10分钟后，将OGD培养基的pH值调节至7.4。使用50毫升滤器系统过滤已除气的无葡萄糖培养基。每次实验都必须新鲜配制OGD培养基。

这将确保培养基中的氧气被彻底清除。移除星形胶质细胞培养基，并用细胞用 PBS 洗涤两次，以去除细胞中的葡萄糖。向孔板中加入 OGD 培养基。

将多孔板敞盖置于缺氧舱内。将混合气体连接至进气阀，并保持出气阀打开。以每分钟10至15升的流速，用混合气体冲洗舱体5至7分钟。

停止气体流动，首先关闭出口阀上的夹子，然后关闭气体入口阀管路上的夹子。将缺氧室置于细胞培养箱中，在37摄氏度下进行所需时间的氧糖剥夺（OGD）处理。

孵育结束后，吸除氧糖剥夺培养基，小心地向细胞中加入完全DMEM以恢复常氧条件。将细胞放回培养箱中，在常氧条件下分别培养0、24和48小时。本方案描述了从新生大鼠大脑皮层中分离星形胶质细胞的方法。

在验证原代培养物的纯度后，进行了氧糖剥夺（OGD）实验。在此类缺血样模型中，通过使用星形胶质细胞标志物（如GFAP）或增殖标志物（如PCNA）进行免疫荧光染色，监测由葡萄糖和氧气剥夺所诱导的更显著的形态学变化。该模型的优势之一在于，能够让我们研究特定细胞类型的反应。

尽管该技术的局限性在于由于星形胶质细胞被分离，导致细胞间相互作用的缺失。克服这一局限性的可能方法之一，是将星形胶质细胞暴露于其他细胞类型的条件培养基中，或采用共培养体系。总之，在分离的细胞系统中采用氧糖剥夺方法，可使我们直接检测不同神经保护性或神经毒性分子的作用。

此外，它也是研究星形胶质细胞生物学的有效工具。最后，该模型为在体内实验条件下研究发育中的药物奠定了坚实基础。