星形胶质细胞三维共聚焦形态计量分析方案

本实验的总体目标是通过分析经共聚焦显微镜获取的星形胶质细胞三维图像，来评估星形胶质细胞的形态。该方法可用于评价多种细胞类型在病理条件下或干预策略作用下可能出现的形态学变化。该技术的主要优势在于，可同时研究与细胞结构相关的多个参数。

Dr. Mariam Bodel 将演示该实验步骤：免疫组织化学染色载玻片制备完成后，将切片浸入二甲苯中两次，每次10分钟以脱蜡。随后用99.8%、95%和70%乙醇各孵育10分钟，以使组织切片再水化。用PBS缓冲液洗涤后，将载玻片置于1:1500稀释的胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）一抗溶液中，于4°C孵育过夜。

孵育后，用PBS缓冲液洗涤切片3次，每次5分钟。然后在室温下用1:100稀释的碱性磷酸酶标记的二抗溶液孵育载玻片1小时。再次用PBS缓冲液洗涤切片3次，每次5分钟，在使用前不超过30分钟完成洗涤。

向三毫升底物缓冲液中加入一滴红色显色液。将每张玻片在100微升该溶液中避光孵育15至20分钟。然后用PBS洗涤玻片3次，每次5分钟。

最后，用 PBS 将 DPI 按 1:500 稀释后对细胞核进行染色。在切片上滴加一至两滴抗淬灭封片剂，立即用盖玻片封片。将载玻片在 4°C 下孵育 24 至 48 小时后再进行显微镜观察，以确保封片完全。

开始共聚焦显微镜操作时，将玻片放置在显微镜载物台上，并选择63倍物镜。打开采集软件后，点击采集选项卡中的智能设置（smart setup），并选择正确的荧光通道。此处使用DAPI和Alexa Fluor 555。

接下来，单击“最佳信号”，然后单击“应用”。随后单击“设置曝光”，以允许计算机确定最佳曝光参数。为优化图像，请打开通道窗口并将图像切换为实时模式。如有需要，调整焦距。

然后点击一个au以优化针孔，调节增益以获得最佳强度。最后，将数字增益设置在2到3之间。完成此优化后，停止实时成像并打开采集模式窗口。

通过点击 X 乘以 Y 来调整帧大小，并选择 10 24 乘以 10 24。同时选择较慢的速度。接下来，打开平均值选项卡，并选择一个大于或等于四的数值。

然后点击拍摄按钮，保存捕获的二维图像。要设置三维成像，请打开智能设置选项卡并选中ZS堆栈项，这将打开Zs堆栈窗口。为Zack设置起始和终止位置时，再次点击实时按钮，并将焦距调整至星形胶质细胞的最顶端位置。

首先点击“设置起始”。然后将焦距调整至星形胶质细胞的最低位置，点击“设置终止”，随后停止实时观察。接下来，通过点击“最佳”来选择间隔。

在此设置切片数量，间隔为 1.01 微米。最后，单击开始实验，扫描完成后保存图像。同时，使用 10 倍或 20 倍物镜获取一幅 2D 图像。

进行荧光强度测量时，在图像窗口中选择矩形或圆形工具，圈定待测区域，以定量分析星形胶质细胞核、胞体及其支配区域的体积和表面积。将3D图像导入合适的分析软件程序（例如分析软件中的Velocity 6.1），创建一个新的库，并将所有图像拖动至左侧的灰色列中。

选择一个3D图像，并开启所获取的感兴趣通道之一，例如dapi。对于细胞核测量，手动调整亮度以优化对比度。现在选择工具菜单。

选择“合并体积”，并从Zack图像生成单个3D图像。打开编辑菜单，点击属性，确保显示X、Y和Z属性。

接下来，从工具栏中选择自由手绘 ROI 工具。使用选定的工具，在标注为 DPI 的细胞核周围绘制线条，以测量星形胶质细胞核的体积和表面积。再次使用自由手绘 ROI 工具，沿着细胞体及其所有分支的表面绘制线条，以测量整个星形胶质细胞的体积和表面积。

单击图像窗口顶部的测量菜单，将“find objects”拖动到窗口顶部，为群体一命名一个描述性名称，选择相应的颜色，然后单击“measure”，这将打开一个新窗口。在此新窗口中，选择体积或表面积作为参数，然后单击“okay”。

为保存数据，请点击测量菜单并选择“创建测量项目”。在窗口中选择一个新测量项目，输入数据的文件名，然后点击“确定”。

最后，将测量数据导出至适当的软件包，以进行统计分析并生成数据图。在此实验中，研究人员比较了经β-淀粉样蛋白1-40处理或经β-淀粉样蛋白1-40与Ian共同处理的大鼠固定脑组织中的星形胶质细胞。注射淀粉样蛋白后，星形胶质细胞的分支变得更粗且更长。

经 Ian 处理的动物来源的这些星形胶质细胞呈现出星状形态，具有短而细的分支。经 Ian 处理的大鼠脑切片中也表现出星形胶质细胞 GFAP 阳性荧光减弱。对特定星形胶质细胞体积的形态计量学分析显示，与仅给予淀粉样蛋白处理相比，Ian 处理后星形胶质细胞的细胞核、胞体、整个星形胶质细胞以及星形胶质细胞所占区域的体积均有所减小。

一旦掌握了该图像分析技术，只要操作得当，每个细胞的分析可在几分钟内完成。在进行该实验步骤时，精确标记结构至关重要。建议在实验开始前，先手动练习标记目标结构，以确保准确性。

该技术为细胞生物学、组织学和病理学领域的研究人员探索健康或疾病状态下细胞结构铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用三维图像测量单个细胞的12种不同参数。