生理氧条件下人细胞中帽结合蛋白的分析

本实验的总体目标是在低氧条件下捕获帽结合蛋白。该方法利用与琼脂糖连接的七甲基鸟苷帽类似物，来研究帽结合因子及其相互作用伙伴。该方法将有助于回答蛋白质合成领域中的关键问题，例如鉴定参与帽依赖性翻译的新型氧调控因子。

该技术的主要优势在于，细胞从培养到裂解的整个过程均保持在低氧工作站中。该技术的应用意义延伸至癌症治疗领域，因为肿瘤内的癌细胞处于极低的氧气环境中，而翻译调控在肿瘤进展中起着关键作用。我们最初产生该方法的想法，是源于阅读了Corona同事近期发表的一项研究，该研究报道组织的实际氧合水平更接近于我们所说的低氧状态，而非细胞常规培养所用的常氧条件。

按照文本方案中所述的细胞培养步骤开始本实验。使用血细胞计数板计数细胞后，将细胞接种于直径150毫米的培养皿中，每皿加入15毫升完全培养基，使细胞密度达到每平方厘米2500至5000个细胞。每个帽结合实验需使用两个直径150毫米的培养皿。

将接种后的培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳气氛的培养箱中。待细胞培养至少24小时后，将细胞放入低氧工作站中处理所需时间。随后，将工作站调节至相应的生理氧浓度。

将一份X浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶在37摄氏度水浴中预热30分钟。每个帽结合实验分别取980微升裂解缓冲液加入1.5毫升离心管中。在冰上向980微升裂解缓冲液中加入10微升100倍蛋白酶抑制剂混合液和10微升4-苯磺酰氟盐酸盐。

在低氧工作站内，将每个150毫米培养皿中的培养基弃入废液容器中。随后，用3至4毫升预热的1× PBS洗涤细胞，并弃去液体。向每个培养皿中加入1毫升预热的0.5%胰蛋白酶EDTA，静置2分钟，或直至细胞不再贴附于培养皿表面。

使用移液器将一个培养板中的细胞转移至1.5毫升微量离心管中。根据需要重复此操作，使每个培养板的细胞分别转移至单独的1.5毫升微量离心管中。在6000 ×g 条件下离心90秒，使细胞沉淀。

离心后，用移液器吸取胰蛋白酶，注意不要扰动沉淀。用预热的1× PBS洗涤细胞，将200微升PBS轻轻滴加到离心管中沉淀上方。然后用移液器吸除PBS，注意不要扰动沉淀。

接下来，从已配制的1毫升裂解缓冲液中吸取500微升，加入第一个细胞沉淀中。通过反复吹打彻底重悬沉淀。将重悬的细胞与第二个细胞沉淀混合，并通过反复吹打将第二个沉淀完全重悬。

对每个样品重复此步骤，直至所有沉淀均已合并并重悬。接下来，将裂解液与剩余的 500 微升裂解缓冲液加入一个 1.5 毫升的微量离心管中。从低氧工作站中取出样品。

将样品在4°C下轻轻振荡1.5至2小时，以裂解细胞。孵育结束后，在4°C下以1200 × g离心15分钟，去除细胞碎片。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，弃去沉淀。

保留一部分上清液，作为蛋白质印迹分析的全细胞裂解液输入对照。为准备帽结合实验，用剪刀剪去移液器吸头尖端，以便收集珠子悬液。每个样品分别将50 µL的空白琼脂糖珠对照悬液和50 µL的m7GTP琼脂糖C10偶联珠悬液转移至不同的1.5 mL微量离心管中。

然后，将悬液在500 × g离心30秒，使磁珠沉淀。小心移除上清液，并将磁珠重悬于500 µL的TBS中。重复上述步骤后，再次在500 × g离心30秒沉淀磁珠，并移除上清液。

接下来，将含有裂解液的上清液转移至含有空白琼脂糖珠的1.5毫升微量离心管中。在4°C下轻轻振荡孵育10分钟。10分钟后，于500 × g离心30秒，使空白琼脂糖珠沉淀。

离心后，将未结合到珠粒的裂解液转移至含有m7GTP琼脂糖C10连接珠粒的1.5毫升微量离心管中。用500微升裂解缓冲液重悬空白琼脂糖珠粒，于500 × g离心30秒使珠粒沉淀，弃去上清液。重复此步骤四次，共洗涤五次。

将空白琼脂糖珠重新悬浮于一倍体积的SDS-PAGE上样缓冲液中，95摄氏度煮沸90秒。将样品于20摄氏度保存，用于后续的Western印迹分析，以观察目的蛋白是否非特异性结合到珠子上。

将裂解液与 m7GTP 交联 C10 琼脂糖 beads 在 4 摄氏度下轻柔振荡孵育一小时，以捕获帽结合蛋白。振荡结束后，于 500 × g 离心 30 秒，收集 m7GTP 交联 C10 琼脂糖 beads。弃去上清液后，按前述方法洗涤 m7GTP 交联 C10 琼脂糖 beads。

将珠子重悬于 600 µL 裂解缓冲液中，并加入 GTP 至终浓度为 1 mmol/L。将 m7GTP 琼脂糖 C10 偶联珠子与 1 mmol/L GTP 在 4 °C 条件下轻轻振荡孵育 1 小时。此步骤可解离与 m7GTP 非特异性结合的蛋白质。

将m7GTP琼脂糖C10交联珠在500 × g离心30秒以收集沉淀。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，并加入200微升4× SDS-PAGE上样缓冲液。按照之前的方法洗涤珠子后，将珠子重悬于1× SDS-PAGE上样缓冲液中，在95°C下煮沸90秒。

图中显示了在氧浓度波动条件下，人原代肾近端小管上皮细胞中两种主要帽子结合蛋白的典型 m7GTP 亲和纯化结果的代表性 Western 印迹。细胞裂解物分别暴露于 8%、5%、3% 或 1% 氧气环境中 24 小时。泳道包括：占总细胞裂解物 10% 的上样输入量（input）、经 GTP 洗脱以检测 m7GTP 特异性的对照，以及 GTP 洗脱后仍结合于 m7GTP 琼脂糖 beads 上的蛋白。

通过 Image J 对至少三次独立实验的数据进行量化，并以相对于全细胞裂解液10%输入量的相对密度单位表示。结果表明，在生理氧条件下培养的人类细胞利用两种帽结合蛋白来招募不同的 mRNA 进行翻译。观看本视频后，您应能充分理解如何在低氧条件下捕获帽结合蛋白。

进行此操作时，重要的是要记住，在裂解之前始终将细胞保留在低氧工作站中，因为氧气会迅速改变这些翻译起始因子的生物化学特性。在此步骤之后，可进一步采用其他方法（如多聚体分离纯化）来回答更多问题，例如在低氧条件下哪些帽结合蛋白与活跃的翻译过程相关联。