一种简单的单步解剖方案用于成年个体整体装片制备 果蝇 大脑

本实验方案的总体目标是描述一种简单的一次性解剖成年黑腹果蝇（Drosophila）大脑的操作步骤，可快速获得形态保存良好的大脑组织，适用于整体封片分析。该方法有助于回答神经科学和遗传学领域的相关问题，包括大脑神经环路的精细定位、神经元遗传操作效应的研究，以及基因的功能特性分析。

该技术的主要优势在于其操作简单易学。它能够在不到10秒的时间内完成成年果蝇脑组织的解剖，且脑形态保持良好。本方法的视频演示至关重要，因为在释放镊子以撕除包围果蝇头部的外骨骼时，需要掌握特定的力度和技巧，这依赖于熟练的操作经验。

这些微小而烦人的果蝇使我们对生物学原理有了深入的了解。它们还可能帮助我们找到人类疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）的病因与治疗方法。使用体视显微镜并调节至1.2倍放大倍数，固定一只已麻醉的果蝇，并将其浸入冷的解剖液中，使腹部朝上。

将镊子与解剖板保持 160 至 170 度的夹角，然后对果蝇的腹部施加轻微力量。此操作应可固定果蝇，使其头部向后倾斜 15 至 25 度，并使喙向上伸展。完成此操作后，喙下方几丁质层内一个柔软且半透明的区域应变得明显可见。

增加放大倍数，并调节焦平面至该区域。用主手取一对解剖镊子，施加压力使镊尖闭合。将镊子垂直于固定果蝇的镊子放置。

将镊子的闭合尖端穿过角质层柔软半透明的区域，注意不要刺入过深而触碰到脑组织。然后迅速但稳定地松开镊子，使镊尖张开，撕开果蝇头部的外骨骼。利用松开镊子尖端时产生的动量，轻柔地一次性将外骨骼以及与头部组织相连的大部分眼和气管从脑组织上移除。

此时应可见完整的大脑。使用镊子小心地去除残留的附属组织，例如白色的纤维状气管组织，注意不要牵拉或损伤脑实质。将分离出的脑组织样本连同相关躯干放入约1毫升的4%多聚甲醛中，置于冰上固定40至60分钟。

移除多聚甲醛，然后用一毫升一倍浓度的 PBS 溶液上下吹打三次，清洗样品，注意不要吸出脑组织。接着移除 PBS，再用一毫升一倍浓度的 PBT 溶液在振荡器上洗涤五次，每次五分钟。加入适当稀释比例的目标一抗抗体。

然后将样品在4°C条件下加入振荡器中孵育过夜。去除一抗，用1毫升1×PBT溶液振荡洗涤样品五次，每次洗涤5至10分钟。将二抗按适当稀释比例加入洗涤后的样品中，并按照相应的孵育时间进行孵育。

随后，将样品在 1 毫升 1× PBT 溶液中以旋转振荡方式洗涤 6 次，每次 10 分钟。此步骤至关重要，可去除非特异性结合的二抗。将样品置于含 1 毫克/毫升 DAPI 的 1× PBT 溶液（稀释比例为 1:10,000，总体积为 1 毫升）中，旋转振荡孵育 30 至 60 分钟。

最后，加入一毫升 1× PBS 缓冲液冲洗样品，然后用移液器将溶液上下吹打三次。将盖玻片置于载玻片上。使用带有切口吸头的移液器，将处于 1× PBS 溶液中的脑组织转移至盖玻片上。

接下来，使用镊子将脑组织与身体分离。用细小的移液枪头吸除脑组织周围的液体。然后，加入 20 至 40 微升的抗荧光淬灭封片介质。

轻轻展开脑组织，同时将黏稠的介质向外推移。从一侧开始，缓缓放下第二块盖玻片覆盖在样品上，注意尽量减少脑组织与气泡的接触。让盖玻片自然沉降，随后用实验室擦拭纸吸去盖玻片边缘多余的液体。

使用一小块胶带将盖玻片成对临时固定在载玻片上。使用复合荧光显微镜或共聚焦显微镜对样品进行成像。这些图像显示了同一只成年黑腹果蝇的腹面和背面视图。

通过DAPI染色观察细胞核，并使用泛神经元标记物和抗ELAV抗体标记神经元。多巴胺能（DA）神经元通过抗TH抗体染色显示。在所有图像通道中，大脑两侧的荧光强度水平相似。

大脑前部和后部的放大视图可对多巴胺能神经元簇进行详细检查。在大脑前部图像中可见成对的前内侧簇，而在大脑后部可见成对的后内侧簇和成对的后外侧簇。对这些神经元的定量分析显示，三日龄雄性w1118品系果蝇全脑中PPM簇通常有27个多巴胺能神经元，每侧半脑PPL簇有16个，每侧半脑PAL簇有5个。

每个PAM簇中平均观察到97个多巴胺能神经元。对PAL和PAM簇进行三维重建还显示，PAM簇中的多巴胺能神经元体积相对较小，且TH染色强度弱于其他簇（如PAL簇）中的神经元。越来越多的研究开始关注成年果蝇大脑，以解析高级脑功能背后的分子通路和神经环路，并用于模拟人类脑部疾病。

在这些基于大脑的研究中，高效地制备形态保存良好的脑组织样本是必要的。这在大规模的基于大脑的筛选中可能尤为重要。当我费力地用镊子夹住果蝇时，首次产生了这种方法的想法。

与大多数果蝇研究人员使用的尖头镊子不同，Shebna 尝试了钝头镊子，发现这样更容易解剖脑组织。一旦掌握，若操作得当，该技术可在不到 10 秒内完成。我曾在一个实验中，仅用一天时间就解剖了六种不同基因型的约 100 个果蝇脑组织。

尽管这种解剖操作看似简单，但首先使用非珍贵果蝇进行练习非常重要。研究者在使用镊子时可能会遇到困难，难以在不损伤果蝇脑组织的情况下准确定位。所获取的解剖脑组织可用于其他研究，例如RNA分析、原位杂交，以及从脑组织中提取蛋白质和RNA样本。

观看本视频后，您应能够解剖出形态保存良好的果蝇大脑。我们预测，未来可对该方法进行改进，使其操作更简便、更快速。该技术未来有望实现自动化，用于大规模研究。

请注意，使用多聚甲醛和锋利的解剖镊子可能存在危险。处理固定液时应采取预防措施，例如佩戴手套；解剖完成后，应立即将镊子盖上盖子后再放置一旁。