在Drosophila melanogaster轴突死亡过程中对轴突及其突触的形态学与功能评估

本果蝇损伤实验方案的总体目标是观察轴突及其突触的形态保持情况，以及突触功能。这些检测方法还可用于表征神经元维持因子、研究轴突运输或分析完整轴突内的轴突细胞器。果蝇翅膀部分损伤检测法能够在同一神经束内，对发生退变的损伤轴突与未损伤的对照轴突进行并行观察。

该损伤实验可预先在野生型果蝇中进行，使用显微剪刀在翅中部大致位置进行切割。内部损伤可用于评估轴突形态，并结合光遗传学技术来观察轴突及其突触功能的保存情况。触角切除需要操作者手部稳定。

建议事先在野生型果蝇中练习去除触角的操作。此外，任何可用的光遗传学装置均可用于激活戴帽果蝇中的神经元。否则，也可以从头搭建一个简单的装置。

首先，选取五只未交配的雌性个体和五只雄性个体（具有目标基因型），在室温下进行杂交。每隔三至四天，将 P0 代转移至新的培养瓶中。每天收集新羽化的成年 F1 代子代，放入新的培养瓶中，并培养 7 至 14 天。

麻醉后，使用显微剪刀在翅内侧翅脉的大致中点处进行剪切。一只翅用于造成损伤，另一只翅作为年龄匹配的未损伤对照。每只翅施加一次损伤，并确保共获得15只损伤翅。

将果蝇回收至含有食物的小瓶中。随后，用移液器将10微升卤代烃油27均匀涂抹在整个玻片表面。在损伤后一天或七天，使用显微剪刀剪下受损翅膀以及未受损的对照翅膀。

使用镊子在翅的中心位置夹取，将最多四片翅置于卤代烃油 27 中，并加盖盖玻片。利用转盘共聚焦显微镜可轻松获取翅中 GFP 标记神经元的图像。然而，由于样本未固定，加样后必须在八分钟内完成图像采集。

立即使用转盘显微镜对翅膀进行成像。沿Z轴以0.33微米的步长采集一系列光学切片，并将Z轴图像堆栈压缩为单个文件以供后续分析。将五只未交配的雌性与五只相应基因型的雄性杂交，按前述方法收集F1代。

麻醉后，使用镊子压碎右侧第三触角节以进行单侧消融，或同时压碎左右两侧第三触角节以进行双侧消融。该操作可去除表达GFP的神经元胞体，而其轴突投射仍保留在中枢神经系统中。根据本技术中所用的GFP标记神经元，需明确神经元胞体位于第三触角节还是第二触角节，以便后续进行损伤实验。

将果蝇回收至含有食物的试剂管中。麻醉后，用镊子夹住颈部，另一把镊子固定胸部，轻轻将头部和颈部从胸部拉下。

用镊子夹取已浸入固定液的样品，将所有头部组织转移至含有1毫升固定液（含4%多聚甲醛和0.1% Triton X-100的PBS溶液）的1.5毫升微量离心管中。在室温下轻轻振荡固定20分钟。随后将微量离心管置于冰上，使头部组织沉降至管底。

用移液器吸去上清液，加入1毫升含0.1% Triton X-100的PBS洗涤缓冲液。将离心管置于室温下的旋转摇床上洗涤2分钟。重复洗涤四次，以去除残留的固定液。

制备脑组织后，取一片盖玻片，在其上粘贴实验室胶带，并将胶带剪成“T”形。使用20至200微升的移液枪头，将其尖端剪去约3毫米，以扩大移液口。用该移液枪将含有抗荧光淬灭剂的脑组织样品移至载玻片上，然后用盖玻片覆盖脑组织。

用黏土制作两条较小且均匀的条状物。确保黏土条的高度不超过载玻片的高度。将黏土条粘贴在载玻片上，然后将含有脑组织的盖玻片夹心结构放置在黏土条上。

按照文稿步骤进行操作。为准备用于光遗传学实验的果蝇，首先将果蝇培养基在微波炉中融化。待培养基冷却但尚未凝固时，加入溶于乙醇的20毫摩尔全反式视黄醛，使其终浓度达到200微摩尔。

充分混匀后立即将培养基倒入空的试剂瓶中。用塞子或脱脂棉封住装有凝固培养基的试剂瓶。用铝箔包裹试剂瓶。

然后，将含有食物的离心管置于避光的低温房间中保存。取五只未交配的雌性个体和五只相应基因型的雄性个体，在室温下进行杂交，将F1代收集到铝箔包裹的离心管中，管内食物含有200 µM全反式视黄醛。接着，通过轻敲将含有食物的离心管中的果蝇转移至不含食物的空离心管中以收集果蝇。

将小管放入含水的冰中冷却约30秒，果蝇会进入睡眠状态。随后，迅速将单个果蝇放入被盖玻片覆盖的小室中，以进行光遗传学实验。

在暗室中，执行以下程序：先进行30秒无红光照射，随后进行10秒、10赫兹的红光照射。重复此过程共三次，最后再进行一次额外的30秒无红光照射间隔。从每个小室中收集个体果蝇，置于二氧化碳垫上。

为了对它们进行触角损伤处理，消融左右两侧的第二触角节段。这将去除约翰斯通氏器官神经元的胞体，而轴突投射仍保留在中枢神经系统中。将果蝇回收至含有200毫摩尔全反式视黄醛的铝箔包裹的玻璃小瓶中。

在相应的时间点，例如触角切除后七天，对果蝇进行另一次梳理行为检测。本方案中介绍了三种研究被切断的轴突及其突触形态与功能的方法。第一种方法可实现对外周神经系统中单个轴突的高分辨率观察。

此处展示了在翅中产生野生型和highwire突变克隆的示意图杂交方案。图中还展示了损伤后GFP标记轴突的对照结果，箭头指示了被切断的轴突。此外，还介绍了第二种研究脑内GFP标记的感觉神经元轴突死亡的方法。

此处展示了用于在脑中产生野生型和 highwire 克隆的示意图杂交方案。图中示例显示了损伤后对照组中GFP标记的轴突，箭头指示被切断的轴突束。第三种方法展示了在轴突切断后观察轴突和突触功能的研究途径。

此处展示了用于产生野生型和过表达 dnmnat 的约翰斯顿器官感觉神经元的示意图杂交方案。野生型果蝇含有轴突退化受到抑制的约翰斯顿器官神经元。两种果蝇在损伤前均表现出强烈的梳理行为。

然而，在损伤后七天，野生型果蝇无法通过光遗传学诱导产生理毛行为，而轴突退变减弱的果蝇仍能继续理毛。在此，我们利用基因功能缺失突变或基因表达操作来观察轴突形态或突触功能的保留情况。也可应用其他修饰方法，例如RNA干扰介导的基因敲低或组织特异性的CRISPR-Cas9介导的基因敲除。

这些方法可用于与损伤无关的研究场景，能够对完整轴突中的神经元维持因子在衰老过程、轴突运输及轴突细胞器中的作用进行观察和表征。