一种用于斑马鱼发育长期成像的通用固定方法

本方法的总体目标是固定斑马鱼胚胎，以进行活体成像，同时允许其后部体区正常伸展生长。该方法也可调整用于斑马鱼发育过程中其他区域的成像。该技术有助于回答发育生物学中的关键问题，例如单个细胞行为如何导致整个组织水平的形态发生。

该技术的主要优势在于能够在保持胚胎正确朝向的同时，使后部身体保持自由活动。首先，在50毫升离心管中将低熔点琼脂糖以1.5%的终浓度加入E3培养基中，并通过微波加热溶解琼脂糖。随后将溶液置于水浴或台式培养箱中，使其温度平衡至42至45摄氏度。

根据文本方案拉制玻璃针后，使用一对镊子在针尖弯曲处稍后位置将其折断，以获得一个整齐且锋利的针尖，用于调整胚胎方向并去除多余的琼脂糖。将胚胎在 E3 培养基中培养至适当发育阶段。

然后在双目解剖显微镜下，使用一对尖头镊子去除胚胎的卵膜。将去卵膜的胚胎在三卡因工作液中孵育至少五分钟。接着用玻璃巴斯德吸管将去卵膜的胚胎连同极少量E3培养基直接转移至装有45摄氏度琼脂糖的50毫升离心管中。

将胚胎连同约1毫升的包埋琼脂糖一起取出，并将含有胚胎的约100微升培养基转移至35毫米玻璃底培养皿底部的10毫米微型孔的中心。在包埋介质凝固过程中，将胚胎移至琼脂糖圆圈的边缘，使尾部朝外。使用毛细玻璃针尽可能将胚胎调整为侧向，以便观察后部体节的发育。

然后用毛细管保持胚胎处于所需的一侧朝向，直至凝胶完全凝固。一旦琼脂糖液滴凝固，使用三卡因工作液充满培养皿。接着，在带有透射光底座的解剖显微镜下，调整反射镜的位置和入射光的角度，使高对比度能够清晰显示琼脂糖中的切口。

进行第一次切割时，使用毛细针或微型手术刀，在卵黄囊附近、卵黄中段位置，沿正在形成的心区后方至第五个体节前缘，以锯切方式上下移动，完全穿过琼脂糖直至玻璃表面。关键在于切割卵黄囊上方的琼脂糖时，务必确保胚胎不受损伤。接下来进行第二和第三次切割，从胚胎侧方开始，垂直切割至玻璃表面，与前五个体节呈切线方向，以便后部躯体背侧能够展开。

然后，从第一条切口和第三条切口的交点开始，沿第三条切口末端方向缓慢进行斜向切割，同时缓慢向上抬起，以松动包围胚胎后部的琼脂糖块。使用一对尖头镊子，在将琼脂糖块提起时借助培养皿壁作为支撑，从胚胎培养基中移除已松动的琼脂糖块。在样品安装前，用1%琼脂糖E3溶液在100毫米塑料培养皿中制备高度为5毫米的涂层，并使其凝固。

然后在培养皿中央加入一滴1 mL的低熔点琼脂糖，并使其同样凝固。将胚胎包埋于低熔点琼脂糖中，操作方法如本视频前面所示。但此次需用较小的一滴溶液从50 mL琼脂糖管中取出胚胎，并将这小滴溶液置于培养皿中央1 mL琼脂糖液滴的上方。

使用毛细玻璃针将胚胎置于小液滴中央，并保持其正确方向，直至凝胶凝固。最后，用三卡因工作液充满培养皿，去除多余的琼脂糖。本动画视频展示了一个注射了编码光转化荧光蛋白kikumeGR的mRNA的斑马鱼胚胎，在15体节期进行封片，并进行连续12小时延时成像的示例。

后部躯体可自由活动，并表现出与在正常培养条件下脱离绒毛膜发育的胚胎相似的形态变化。在本视频中，胚胎在16细胞期被注射了编码组蛋白2B-RFP（标记细胞核）和CAAX-GFP（标记细胞膜）的mRNA。从10体节期开始，使用配备25倍水浸物镜的直立式双光子显微镜连续采集图像长达三小时，以观察尾芽形成过程中的细胞行为。

在尾芽正常形成的过程中，可以观察到细胞产生活跃的突起并进行定向移动。一旦掌握该技术，若操作得当，可在20分钟内完成。在操作过程中，需确保胚胎在琼脂糖凝胶凝固期间保持侧向位置。

否则，在成像过程中，目标区域将迅速移出视野。观看本视频后，您应能够清晰掌握如何对斑马鱼胚胎进行固定，以实现尾部体轴伸长过程的活体成像。