通过整体荧光标记联合方案可视化斑马鱼中的多纤毛细胞 原位 杂交与免疫荧光

本方案的总体目标是对斑马鱼体内的多纤毛细胞进行原位标记和可视化。该方法有助于回答发育生物学领域的一些关键问题，例如：哪些因素调控了胚胎期斑马鱼肾脏中多纤毛细胞的功能？该技术的主要优势在于可同时标记蛋白质和RNA转录本，这在缺乏斑马鱼特异性抗体的情况下尤为有用。

在分析胚胎经修饰后纤毛的存在情况时，我们首先想到在原肾中对多纤毛细胞进行标记。从受精后24小时的斑马鱼胚胎开始，在室温下用5毫升4%多聚甲醛固定2至4小时，无需振荡。接着，用含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液（PBS-T）清洗胚胎两次，随后用5毫升100%甲醇清洗一次。

然后，将胚胎在 5 毫升新鲜的 100% 乙醇中于 -20 摄氏度孵育至少 20 分钟。为准备杂交，将新生胚胎在 5 毫升 50% 甲醇和 PBST 中重水化 5 分钟，随后在 5 毫升 30% 甲醇和 PBST 中继续重水化 5 分钟。用 5 毫升 PBST 将胚胎清洗两次，每次 5 分钟，并将胚胎立即转入 5 毫升蛋白酶 K（1:1,000）与 PBST 的混合溶液中孵育 2 分钟，之后再用 5 毫升 PBST 清洗两次。

在室温下，用5毫升4%多聚甲醛固定胚胎，时间不少于20分钟，随后用5毫升PBST 20清洗两次。为促进胚胎与杂交溶液之间的相互作用，将胚胎转移至直立的平底微量离心管中（每管含5毫升PBST），置于微量离心管架上，再用1.5毫升杂交溶液洗涤胚胎两次，每次5分钟。第二次洗涤后，将胚胎在杂交炉中70摄氏度条件下，于1.5毫升新鲜杂交溶液中孵育4至6小时。

然后，将杂交液替换为10微升目标RNA探针和500微升杂交液，在70摄氏度下进行过夜探针杂交。次日早晨，在70摄氏度下用1.5毫升含50%甲酰胺的2X盐酸钠-柠檬酸钠缓冲液（SSC）洗涤胚胎两次，每次20至30分钟。接着，在70摄氏度下用1.5毫升2X SSC单独洗涤胚胎一次，持续15分钟，随后在70摄氏度下用1.5毫升0.2X SSC洗涤两次，每次20至30分钟。

第二次洗涤后，加入1.5毫升封闭剂，于4摄氏度下过夜孵育。次日早晨，将封闭剂更换为0.2毫升以1:1,000比例稀释于封闭剂中的辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于室温避光孵育3小时。随后，用1.5毫升马来酸缓冲液洗涤胚胎2至4次，每次洗涤10至15分钟，接着在1.5毫升新鲜的马来酸缓冲液中于4摄氏度下过夜孵育。

第二天早晨，将苹果酸缓冲液替换为1.5毫升PBS，用1.5毫升PBS洗涤胚胎两次，每次洗涤5分钟。将胚胎在0.2毫升Si3荧光染色液中于室温孵育60分钟，随后用1.5毫升浓度递增的甲醇溶液连续洗涤四次，每次10分钟。最后一次孵育后，将胚胎在1.5毫升含1%过氧化氢的甲醇溶液中于室温孵育30分钟。

然后，将胚胎在1.5毫升梯度甲醇溶液中依次洗涤，每次10分钟，随后在1.5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤两次，每次5分钟。接着，将胚胎在1.5毫升双蒸水中洗涤5分钟，随后在1.5毫升-20°C的丙酮中洗涤7分钟。再将胚胎转移至另一份1.5毫升双蒸水中洗涤5分钟，最后在含1% DMSO或PBDT的1.5毫升PBST中洗涤5分钟。

将胚胎置于含有10% FBS的1.5毫升PBDT中，在室温下于摇床上孵育2小时。随后，弃去PBDT和FBS，加入1.5毫升一抗溶液，在4°C条件下过夜孵育。次日早晨，先用含FBS和0.1摩尔氯化钠的1.5毫升PBDT在摇床上洗涤胚胎1分钟，随后用含FBS和氯化钠的1.5毫升PBDT在摇床上进行5次、每次30分钟的洗涤。

最后一次洗涤后，将胚胎在1.5毫升仅含PBDT、FBS的溶液中洗涤一次，室温摇床上孵育30分钟，随后在200微升相应二抗溶液中，4摄氏度避光孵育过夜。次日清晨，将胚胎在1.5毫升PBDT溶液中快速洗涤两次，随后在1.5毫升DAPI溶液中，室温摇床上孵育15分钟。接着，将胚胎在含FBS和氯化钠的1.5毫升PBDT溶液中洗涤三次，每次洗涤15至20分钟，最后将胚胎保存在1.5毫升PBDT溶液中，4摄氏度避光保存。

为了成像斑马鱼肾脏，将胚胎侧向放置在载玻片上，加入约10微升PBDT。使用一对精细镊子和解剖显微镜，挤压第一个胚胎的眼睛后方，以去除头部及部分卵黄球。然后，轻轻刮除胚胎体上残留的卵黄球。

去除卵黄球时，需小心避免触碰卵黄囊延伸部分，因为目标组织容易撕裂，且位于该延伸结构的正上方。使用一层薄纸巾将玻片上解离的卵黄和多余液体吸除。随后，在残留的尾部加一滴封片剂，并将尾部侧向放置。

用盖玻片压平尾部，并将载玻片放入带盖的玻片盒中。然后，使用共聚焦显微镜的 60X 物镜，在适当的荧光通道下对肾脏中的纤毛进行成像。在接下来展示的斑马鱼胚胎代表性图像中（该胚胎经上述方法染色），可根据反义核糖探针的信号识别多纤毛细胞，该探针用于检测 ODF3B 转录本的表达；同时可观察到标记基体的配子微管蛋白以及标记纤毛的乙酰化 α-微管蛋白。

事实上，在此放大倍数下观察胚胎前肾，可见一个具有 ODF3B 转录本、多个基体和纤毛的多纤毛细胞。相邻的单纤毛细胞则可通过其单一基体和单一纤毛表型加以区分。在进行该操作时，务必使用新鲜固定的胚胎，并在加入第一抗体后，将样品避光保存。