通过油包水乳液离心法制备包封微球的巨型囊泡

本水包油乳液离心法的总体目标是简便地制备单层巨囊泡。该方法有助于回答合成生物学领域中的关键问题，例如基于巨囊泡构建人工细胞。开始该实验前，需在氯仿中配制浓度为 25 毫摩尔的 DOPC 储存液，以及浓度为 0.2 毫摩尔的 Texas Red DHPE 储存液。

接下来，在5毫升玻璃小瓶的内表面形成一层脂质膜，方法是在流动的氮气下蒸发DOPC和Texas Red DHPE储备溶液的混合物。将脂质膜在减压条件下孵育过夜后，向小瓶中加入1毫升液体石蜡。用铝箔包裹小瓶，并将混合物在80摄氏度下孵育过夜。

在一支1.5毫升带盖微量离心管中，加入237.5微升1微米非荧光微球和12.5微升1微米荧光微球。然后向该微量离心管中加入64毫克蔗糖、125微升1摩尔Tris缓冲液以及875微升去离子水。涡旋混匀30秒，随后超声处理10分钟。

配制10毫升Tris缓冲液后，取1毫升置于一个1.5毫升带盖微量离心管中。待溶液经涡旋振荡和超声处理后，在1.5毫升微量离心管中将1毫升油相溶液与300微升内水相溶液混合。使用机械匀浆器在室温下以10,000 rpm转速处理2分钟，使微量离心管中的两相成分乳化。

接下来，在4°C条件下，将300微升水包油乳液轻轻铺加到1.5毫升带盖微量离心管中1毫升外层水溶液的上表面。乳化后立即于4°C预冷10分钟，随后以18,000 × g离心30分钟。离心结束后，用图钉刺穿微量离心管底部，收集一滴沉淀的巨型囊泡（GVs），转移至已灭菌的1.5毫升微量离心管中。

将一个用于NC双聚合酶链式反应和杂交的粘性孵育室置于显微镜盖玻片上。使用微量移液器，将25 µL稀释后的沉淀GVs滴加到样品区域，并立即在孵育室上方放置一个厚度为0.15 mm的盖玻片。记录囊泡的显微图像后，首先将UFBNA和UFMCHE荧光镜组插入显微镜，然后进行荧光显微镜观察。

然后为设备安装用于分析的激发滤光片和发射滤光片。水包油法成功的关键在于内层水溶液的比重必须大于外层水溶液的比重，以确保GVs在离心过程中发生沉淀。对不含微球和含微球的GVs进行微分干涉显微镜和荧光显微镜观察，结果证实形成了低层状结构的GVs。

在获得的160个GV中，55个包裹了微球，105个为空，包封率为34%。GV中微球的体积分数估计约为11±3%（体积百分比），计算体积分数的精度为10%至30%。使用相同的外部水溶液和相同方案，将其他材料包封入100摩尔% DOPC GV中也取得成功，差分干涉显微镜和荧光显微镜结果已证实这一点。按照此方法，还可进行流式细胞术等其他实验，以回答更多问题，例如解析所构建的模拟细胞。

观看本视频后，您应能充分理解如何制备包封有材料的巨型囊泡。