用于制备纳米级脂质囊泡的恒压控制挤出法

以下实验的总体目标是提供一种用于制备具有生物学意义的脂质体的可靠方法。该方法首先将磷脂混合并转移至玻璃小瓶中，然后用缓冲水溶液进行水合，从而形成多层脂质体（SLE）悬浮液。第二步是进行反复冻融处理，由此可将多层脂质体转化为单层脂质体（Ella Vesicles）。

接下来，将脂质体悬浮液在已确定的最佳压力下通过挤出器，以制备所需尺寸的均一脂质囊泡。实验结果表明，基于动态光散射和纳米颗粒追踪分析，所制备的囊泡尺寸稳定且均在亚微米范围内。与超声处理和沉降等现有方法相比，该技术的主要优势在于采用压力控制系统，并结合已优化的氮气流速，可高效地制备尺寸均一的脂质囊泡。

开始此操作前，取一个带聚四氟乙烯衬里瓶盖的20毫升玻璃小瓶，使用前用氯仿清洗所有玻璃器皿和注射器，以防止污染。使用250微升气密式玻璃注射器，将100微升试剂级氯仿转移至该玻璃小瓶中。再使用100微升气密式玻璃注射器，向同一玻璃小瓶中加入30微升试剂级甲醇。

通过转移216微升浓度为10毫克/毫升的pop C、42微升浓度为10毫克/毫升的pop e以及20微升浓度为11毫克/毫升的胆固醇溶液至20毫升玻璃小瓶中，配制2毫摩尔的pop C罂粟胆固醇脂质溶液。使用缓慢流动的氩气或氮气蒸发有机溶剂，直至在小瓶底部观察到一层脂质薄膜。将未加盖的玻璃小瓶置于真空干燥器中至少30分钟。

为去除残留溶剂，将2毫升经0.2微米滤膜过滤过的缓冲液转移至玻璃小瓶中，以水合脂质。将混合物在4摄氏度下孵育过夜，并在48小时内使用，用于制备30至100纳米粒径的脂质体。将脂质体悬浮液在液氮中冷冻15秒。

然后将脂质体悬浮液置于42摄氏度的加热块中解冻，约三分钟。重复冻融过程，共进行五个循环。冷冻和随后的解冻可使多层囊泡形成均一的脂质体，并在挤出过程中提高脂质包封效率。

接下来，按照阿瓦斯汀（Avastin）的说明小心快速地组装脂质体，为挤出做准备。LF 50 挤出器的正确组装对于防止氮气泄漏至关重要，因为氮气泄漏会影响理想的流速。为确保成功，请仔细执行以下步骤。

为形成气密性密封，将大孔支撑筛网放入支撑滤器底座中，随后依次放入圆形中心皿、一个排水盘和一张聚碳酸酯膜。将小黑色O形圈置于膜上，并将其固定到支撑滤器底座上。

通过拧紧四个对应孔中的螺丝来安装顶部滤膜挤出器。将滤膜挤出装置组装在大型挤出筒下方。将脂质体溶液加入挤出筒上方的圆筒形筒管中。

放置一个大号圆形O形圈、窄盖、大号圆形O形圈和圆形盖。将气体调节器连接到挤出机筒体顶部，并关闭所有阀门以防止漏气，包括泄压阀。在挤出机过滤装置下方放置一个20毫升玻璃小瓶或50毫升锥形瓶。

安全阀连接至调压器，当压力超过 600 PSI 时会自动释放。打开氮气，开启与挤出器相连的气体阀门。将氮气压力调节至：制备 400 纳米脂质体时为 25 PSI，制备 100 纳米脂质体时为 125 PSI，制备 30 纳米脂质体时为 400 至 500 PSI。观察脂质体悬液，直至其在氮气推动下喷射进入容器中。

持续通入氮气，直至观察不到液体为止。通过挤出机滤膜进入玻璃样品瓶，进行动态光散射（DLS）分析。首先，准备50微升用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的20微摩尔脂质体溶液。

然后打开电源和光源，启动 Dynapro 软件。将软件设置为用于检测目标尺寸脂质体的算法模型。

将脂质体样品14微升用硬件移液器吸入石英比色皿中，并插入样品池架后，按下开始按钮；经过大约20至30次采集后，按下停止按钮。分析直方图上记录的脂质体平均直径峰。纳米颗粒跟踪分析首先制备500微升、0.1微摩尔的脂质体溶液，用PBS溶解，随后用水和乙醇冲洗样品室。

然后用无绒纸巾将样品室擦干。打开激光电源并启动计算机，向样品室加入300微升0.1摩尔的脂质体溶液。打开温度控制和纳米颗粒跟踪分析软件。

按下捕获按钮以开启激光器。使用水平和垂直调节装置移动载物台，并调节显微镜焦距。设置所需的温度和记录时间。

按下录制按钮，对脂质体颗粒进行指定时长的多帧图像采集。通过分析直方图中对应脂质体粒径大小的峰，追踪每个颗粒的运动情况。动态光散射（DLS）是一种通过收集散射光来测定颗粒直径的成熟方法，本实验采用该方法测定脂质体的粒径大小。

按照书面实验方案所述，将水合脂质体通过不同尺寸和压力的聚碳酸酯膜进行挤出。动态光散射（DLS）测得，使用30纳米孔径时脂质体直径为66 ± 28 纳米；使用100纳米孔径时为138 ± 80 纳米；使用400纳米孔径时为360 ± 25 纳米。

使用50纳米抛光Irene微球的悬浮液作为校准标准，测得其直径为47 ± 16纳米。多分散百分比表明脂质体粒径之间无重叠。由于动态光散射（DLS）分析仪器对较大颗粒存在已知偏差，通常观察到的直径会大于30纳米。

尽管存在这种仪器限制，校准曲线仍描述了线性相关性。纳米颗粒追踪分析是一种新技术，可通过直接观察颗粒在液体介质中的扩散来测量每个颗粒的大小，且该方法不依赖于颗粒的折射率或密度。这种高分辨率技术可用于补充通过动态光散射法对脂质体的测量。用于校准的两种聚苯乙烯溶液，其标称粒径分别为100纳米和400纳米，NTA测得的直径分别为95 ± 48 纳米和356 ± 51 纳米。

脂质溶液的粒径与动态光散射（DLS）测得的结果相比具有更相近的直径，其平均粒径分别为：30 纳米孔径条件下为 29 ± 14 纳米，100 纳米孔径条件下为 95 ± 17 纳米，400 纳米孔径条件下为 359 ± 73 纳米。纳米颗粒追踪分析（NTA）可能是一种更为通用的微观颗粒定量表征技术，因其灵敏度可检测 50 至 1000 纳米范围内的颗粒。校准曲线显示了聚碳酸酯膜孔径与记录的NTA直径之间存在线性相关性。负染透射电子显微镜图像显示，经挤出后形成的各组脂质体粒径（分别为 30、100 和 400 纳米）彼此之间具有明显区分。

放大倍数设定为25,000倍，比例尺代表0.5微米。采用三种不同尺寸的脂质体进行时间进程实验。在挤出后立即对每种脂质体溶液进行动态光散射（DLS）测量。

所有脂质体溶液均在 4°C 下保存过夜。经过过夜孵育后，再次通过动态光散射法（DLS）记录其直径。在 60 小时的孵育期后未观察到明显变化。在进行此操作时，需注意：多次通过挤出滤膜可提高囊泡溶液的均一性。

此外，在样品制备过程中请务必使用玻璃小瓶和注射器，以防止聚丙烯管中的氯仿浸出造成污染。