高通量多参数定量分析的两种算法 果蝇 神经肌肉接头形态学

本实验的总体目标是利用形态学测量软件宏自动量化果蝇神经肌肉接头的形态学特征。该方法有助于识别突触发育的调控因子，这是神经生物学领域的一个关键科学问题。该技术的主要优势在于能够自动量化多个神经肌肉接头的特征。

这使得能够以高通量方式对神经肌肉接头（NMJ）形态进行客观分析。我们决定开发这一方法，以便能够在大量疾病模型中研究NMJ形态。我们思考了如何避免个体差异，以及如何显著加快定量分析过程。

该方法的可视化演示非常有帮助。合适的显微设置至关重要，某些步骤对于新用户而言可能较难掌握，尤其是不熟悉VT软件的情况下。在本实验方案中，需生成神经肌肉接头（NMJs）的图像序列，并将其保存为单独的TIFF文件，其中通道一显示DLG1染色或类似标记物，通道二显示BRP染色。

首先，创建NMJ图像文件的C投影和超堆栈。打开插件选项并选择Drosophila NMJ Morphometrics。接着，识别显微镜在将图像序列存储为TIFF格式时为其分配的独特文件字符串。

这将位于图像名称的末尾。将提供的字符串复制并粘贴到最低平面和通道编号对应的唯一文件字符串设置窗口中。然后，选择子宏“转换为堆栈”，并选择图像所在的目录或文件夹。

对于每个图像文件，将生成两个新文件，其默认名称为“stack”和“flat stack”，后接原始图像的文件名。随后可删除原始文件以节省存储空间。接下来，在 Drosophila NMJ Morphometrics 界面中选择 define ROI 子宏，并选择图像文件所在的目录。

当第一个投影打开时，选择自由手绘选择工具。然后使用鼠标定义一个包含完整目标神经肌肉接头终末的区域。选定后，在“定义终末”窗口中点击“确定”。

继续此操作，直到所有投影中的神经肌肉接头终末均被定义。该宏将自动推进此过程。对于每个图像文件，将生成一个新文件，其默认名称为“ROI”后接原始图像名称。

为了量化神经肌肉接头（NMJ）的特征，首先进入果蝇 NMJ 形态测量界面并设置比例尺。例如，如果图像中一个像素对应 0.72 微米，则将“scale pixels”设为 1，将“scale distance”设为 0.072。然后选择子宏“analyze”，如果图像是双通道图像，还需启用“weight”选项。

点击“确定”，当系统提示时选择图像文件目录。每个突触的处理时间可能需要几分钟。分析完成后，每个被分析突触的新图像文件将存储在父文件夹中，定量测量结果即为分析结果。

txt 文件。检查所有图像，并排除存在分割错误的图片。例如，突触终末的部分区域可能未被包含在黄色轮廓内。

背景的部分区域可能会被包含在突触终末内。蓝色骨架线可能会超出突触终末的范围。活性区可能过多，或者某些活性区可能未被检测到。

如果超过5%的图像存在分割错误，则应尝试不同的分析算法以改善图像处理效果。接下来的视频部分将介绍如何定义这些宏分析设置中的许多参数。要调整宏的滚动球半径值，请选择三个能够代表图像数据集的NMJ Z投影图像。

删除之前由子宏分析创建的结果 res 图像名称和两个活动区域堆栈图像名称。打开每个选定图像的堆栈图像文件，然后从工具栏中选择“拆分通道”，生成通道一和通道二的图像，并保存这些文件。打开属于通道一的图像，本例中该图像对应于 DLG1 免疫标记。

现在，运行位于“Process”选项卡下的“Filter”中的“Subtract Background”功能。将滚动球半径设置为一个能够增强突触与背景之间对比度的数值。创建一个Z轴投影，投影类型选择最大强度投影（Max Intensity），然后保存图像。

然后，使用新的滚动球半径对所有Z投影图像运行背景减除算法，并保存结果。为确定宏的最佳自动阈值，打开已保存的C投影图像，使用“尝试所有”选项运行自动阈值功能。根据所得图像，选择最适合图像数据的算法，并在后续运行宏处理其他图像时采用该阈值设置。

定义不同的自动阈值对于宏实现正确的图像分割至关重要。因此，为了准确量化八个标志参数，有必要熟悉软件提供的16种自动阈值选项。按下加号按钮可放大查看自动阈值处理后的结果图像。

算法名称位于每张结果图像的下方。在此示例中，用于NMJ轮廓阈值设置的最佳自动阈值算法是Huang。对于骨架阈值，最佳设置是Li，而对于活性区阈值，最佳设置是Huang。

为了确定该宏的精细最大值噪声容限值，请返回原始的代表性 NMJ 图像。打开 BRP 通道。在弹出菜单中转到插件选项卡，然后选择最大值 3D。

短暂等待后，将出现一幅新图像，然后关闭原始图像。接下来，使用最小值3D命令。随后关闭C2通道最大投影的“突触1”图像，并选择新生成的“C2通道最大投影突触1的最小值”图像。

现在使用“查找最大值”命令。在新窗口中选择预览点选，并将噪声容限设置为 50。最大值点将用小十字标记，这些标记应仅覆盖突触活性区。

如果生成了过多的交叉点，请增大噪声容差值。如果部分活性区域未被标注，请减小噪声容差值。使用推导出的阈值作为宏中“查找最大值”噪声容差字段的取值。

选择最大噪声容差值对于准确定量活性区数量至关重要。有时需要尝试不同的数值以确定最合适的值。现在，在宏界面中调整阈值算法中的所有衍生值，并在最初用于定义宏设置的代表性图像上运行子宏进行分析。

将创建一个新文件，其中活性区以白点标示。通过将该文件拖放到工具栏中，并选择“Z 投影”（投影类型为“部分切片”），即可打开此文件。由此生成一个投影文件。

下一步是调整阈值。在新打开的阈值窗口中，移动上方的滑块，选择一个能够识别所有目标焦点的阈值，这些即为BRP阳性信号点。

将此值用作BRP突触样点的下限阈值。接下来，使用先前定义的数值、算法以及新的BRP突触样点下限阈值，对原始的代表性NMJ图像重新运行分析。所得图像应符合进行关键性分析的标准。

现在使用定义的设置，在相同条件下获得的所有 NMJ 图像上运行该宏。果蝇 NMJ 形态测量宏被用于验证三种突变基因型中不同的已知突触缺陷。Ankyrin 2 突变体已知具有融合的小体和更小的 NMJ。

利用该宏测量了panuronil和quirin两个RNAi敲低的NMJ的面积和周长，发现其显著小于对照组。GTP酶Rab3对于bruckpila的正常分布是必需的。当其功能受损时，活性区数量减少。

使用巨观泛神经元Rab3基因敲低果蝇后，其NMJ终末平均含有138个活性区，而对照组中检测到的活性区数量为290个。Highwire是NMJ生长的重要调控因子，当其发生突变时，NMJ终末会出现分支延长现象。利用巨观泛神经元highwire RNAi敲低品系，其NMJ在多个骨架衍生参数上均表现出显著增加，包括总长度、最长分支长度、分支数量以及分支点数量。

观看本视频后，您应能充分掌握如何操作和调整果蝇 NMJ 形态测量宏的设置。一旦熟练掌握，可在一小时内完成 50 个突触的分析，相比之前每个突触可节省约 15 分钟的定量时间。

获取高质量的神经肌肉接头（NMJ）图像非常重要。图像质量越高，宏处理的效果就越好。该技术将有助于神经生物学领域的研究人员高效地量化果蝇（Drosophila）神经肌肉接头的形态学参数。