用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

量化组织和细胞器形态变化的能力对于理解基因功能以及遗传突变的影响具有重要意义。我们的实验方案详细说明了如何利用免费软件对线虫秀丽隐杆线虫（C.elegans）中突触、肌肉和线粒体的形态进行非主观性评估。以往许多研究依赖于定性方法来比较形态学变化。

然而，这些方法可能存在一些问题，因为它们可能无法捕捉细微的表型差异，对变化的估计可能过高或过低，且评估过程具有主观性。我们的定量方法为评估形态学变化提供了更可靠且偏差更小的手段。这些方法可轻松用于研究其他细胞结构或模式生物中的形态学变化，从而定义基因功能以及疾病相关突变所导致的后果。

首先准备用于成像的载玻片。将一滴融化的琼脂糖置于显微镜载玻片上，立即用另一张载玻片轻轻按压液滴，使琼脂糖均匀展平。静置干燥一分钟，然后小心分开两张载玻片，将凝固的琼脂糖垫保留在其中一张载玻片上。

将载玻片置于显微镜载物台上，并在琼脂糖垫的中央加入5至10毫升麻醉剂液滴。使用经热灭菌的挑针，在溶液干燥前迅速将10至15只动物从保存培养皿转移至麻醉液滴中。然后，将盖玻片置于琼脂糖垫上方，轻轻放下，使其自然覆盖。

使用配备488纳米和552纳米光泵浦半导体二极管激光器的线扫描共聚焦显微镜，并结合图像采集软件，对突触区域进行成像。找到线虫后，切换至40倍物镜并加入浸油介质。通过552纳米激光（tagRFP荧光团使用1%功率）和488纳米激光（GFP荧光团使用2%功率）激发荧光团，以观察突触区域。

使用混合型光电探测器采集图像，并设置增益以防止荧光染料过曝。根据物镜选择最佳 Z 轴步长，采集覆盖整个突触的 Z 层叠图像。为分析突触区域，首先将图像载入 CellProfiler 3.1.5 软件中。

设置 NameAndType 模块，并通过使用来自 UIS-115 转基因表达的弥散性 tagRFP 手动定义突触区域。通过向流程中添加 MeasureObjectSizeShape 和 MeasureObjectIntensity 模块，测量手动定义的突触的大小和荧光强度。然后通过添加 CalculateMath 模块，将 JSIS37 获得的积分荧光强度单位除以 UIS-115 获得的积分荧光强度单位，计算相对积分荧光强度。

完成测量后，导出所有测量结果和计算数据。要测量肌细胞面积，请在Fiji软件中打开图像，使用多边形选区仔细勾勒单个斜行肌细胞的轮廓。通过拖动锚点调整多边形线条末端，以优化勾勒效果。

转到软件顶部的“Analyze”选项卡，点击“Measure”以计算选定区域。对于发生退化或缺失区域的肌细胞，使用多边形选择工具勾勒缺失区域，然后再次点击“Measure”。如果存在多个缺口，请分别逐一勾勒每个缺口。

计算间隙区域面积与整个细胞面积的比值。该比值较高表明肌肉变性程度较高。若无缺失区域，则该比值记为零。

打开 Elastic，选择“创建新项目”下的像素分类。然后重命名并保存项目。导航到输入数据选项卡，点击“添加新数据”，然后选择“添加单独图像”。

将弹出窗口定位到包含 TIF 文件的文件夹，并选择所需的图像。在“特征选择”选项卡中，单击“选择特征”以选中所有由绿色对勾框标示的像素特征。此步骤中的像素选择将用于在下一步中区分不同类别的像素。

使用训练面板区分表达 GFP 的单个肌球蛋白细丝与不需要的背景。单击“添加标签”，涂抹不需要的背景区域以及细丝之间的空白区域，以开始分类器训练。添加第二个标签，将其重命名为“细丝”，并在多个细丝上进行涂抹。

单击“实时更新”以确保分类已正确完成。如有必要，添加更多涂鸦以微调训练。完成分类器训练后，转到“预测导出”面板，单击“选择导出图像设置”，并将源设置为“概率”。

确保选中裁剪的子区域 x 和 y，而不选中 c。为 c 选择 0 和 1 作为起始值和终止值，并将数据类型转换为无符号 8 位。勾选重新归一化，然后将输出文件视频更改为 png 格式，并根据需要重命名文件和目录。

关闭导出设置窗口，并导出刚刚完成分割的图像。然后在 Fiji 软件中打开该 png 文件。使用默认设置调整图像的阈值，并应用骨架化插件，该插件将生成一个独立的结果表格。

本方案已用于研究α-微管蛋白乙酰转移酶MEC-17在突触发育中的功能。对后侧微管或PLM突触图像的定量分析表明，MEC-17的过表达会破坏神经元的正常功能。与野生型对照动物相比，MEC-17过表达的动物其突触前区域显著减少，突触完整性下降。

这些技术还被用于分析携带与腓骨肌萎缩症2型（CMT2）相关基因突变的秀丽隐杆线虫（C. elegans）模型。对体壁肌肉形态的视觉评估显示，与野生型对照相比，测试动物的缺陷增加了2.5至3.5倍。携带fzo-1和unc-116基因突变的动物出现肌节结构消失、细胞碎片积聚以及肌纤维退化现象。

尽管dyn-1基因突变的动物在肌肉形态缺陷方面显著较少，但fzo-1和unc-116突变体与野生型动物相比，其单个细胞间隙面积与总面积之比增加了五到六倍，且平均纤维长度明显更短。为了在样本之间进行有效比较，确定图像采集的最优条件并确保始终一致地使用这些条件至关重要。

这些技术将使研究人员能够通过定量方法比较不同遗传背景下形态学的变化。这可以减少主观性，从而有助于提高所生成数据的代表性。