通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

本实验策略的总体目标是通过蓝非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离亲和纯化的蛋白质复合物，并结合质谱相关性分析，解析蛋白质可能参与的不同功能复合体。该方法有助于为亲和纯化-质谱联用实验所产生的蛋白质列表添加结构组织信息。该方法的主要优势在于操作简便、分辨率良好，且工作量仅略高于常规凝胶CMSMS分析。

本方案经过优化，适用于从表达内源水平FLAG标签蛋白的2亿至5亿个细胞中纯化蛋白质复合物。按照文本方案所述，将细胞沉淀解冻后，向细胞悬液中加入5毫升含DTT和蛋白酶抑制剂的预冷裂解缓冲液，轻轻摇动混匀。将悬液置于冰上孵育10分钟。

将细胞悬液转移至预冷的下冲式匀浆器中。使用紧密型研杵进行20至30次研磨，直至无明显黏稠感，将匀浆液转移至预冷的微量离心管中。离心后，将澄清的裂解液转移至洁净的预冷离心管中，残留约50微升裂解液于原管中。

保留35微升裂解液用于测定蛋白浓度并监测纯化过程。接着，移除先前准备的珠子中的缓冲液。用一毫升裂解液重悬珠子，然后与剩余的裂解液混合。

将混合物置于4°C的旋转仪上孵育一至两小时。用磁铁将珠子吸附在离心管的一侧。取30 µL上清液作为等分试样，其余弃去。

用移液器将珠子在0.5毫升IPP150缓冲液中吹打重悬4至6次。然后，将悬液转移至一个1.5毫升预冷的离心管中。接着，用0.5毫升FLAG洗脱天然缓冲液洗涤珠子3次。

最后一次洗涤后，将珠子转移至一个新的预冷离心管中。彻底去除缓冲液。将珠子重悬于100微升含有200微克/毫升3X5肽的天然洗脱缓冲液中。

然后，在4°C条件下轻轻旋转孵育10分钟。用磁铁收集磁珠，并将上清液转移至预冷的新离心管中。在收集全部洗脱液之前，重复此步骤两次。

将洗脱液在离心过滤装置中于4°C、10,000 × g条件下离心，浓缩至25微升。向25微升浓缩后的洗脱液中加入4×非变性上样缓冲液和0.5% G-250样品添加剂，制备样品。上样时加入样品及非变性分子量标准品，并在两者之间留出一个空孔。

然后，在所有空的上样孔中加入 10 至 20 微升的 1× 天然样品上样缓冲液。小心地向阴极室加入 200 毫升 1× 天然 PAGE 深蓝色阴极缓冲液，避免扰动样品。向阳极室加入 550 毫升 1× 天然 PAGE 阳极缓冲液。

以150伏电压电泳30分钟。停止电泳后，用血清移液管移除深蓝色阴极缓冲液，并更换为1X浅蓝色阴极缓冲液。继续电泳60分钟后，打开凝胶夹板，弃去其中一块夹板。

凝胶仍附着在另一块夹板上。将凝胶放入盛有足量固定液以完全覆盖凝胶的托盘中，于轻微振荡条件下孵育30分钟。随后弃去固定液，更换为水，再进行凝胶扫描。

为质谱分析做准备，首先将一个锥底96孔板放置在另一个96孔板之上，用于收集废液。用21号针头刺穿锥底96孔板各孔的底部。然后，向穿孔后的孔板各孔中加入200 µL的50%乙腈、0.25%甲酸溶液。

将板堆放入摇床中孵育10分钟。接着，在500 × g条件下离心该板1分钟，使液体通过孔洞流入废液收集板。重复洗涤步骤两次后，向穿孔的96孔板的各孔中加入150 µL 50 mmol/L的碳酸氢铵溶液。

接下来，将凝胶置于干净的表面上。将含有样品的泳道切成48个完全相同的条带。除凝胶顶部最后五个条带外，将每个条带再切成两到三个较小的片段。

将每个切片依次放入已预先清洗并打孔的96孔板的一个孔中。每孔加入50微升乙腈，振荡孵育30至60分钟。离心去除液体后，每孔加入200微升含2毫摩尔TSEB和50毫摩尔碳酸氢铵的溶液。

将平板在室温下振荡孵育30分钟，然后同前通过离心去除液体。加入200 µL纯乙腈使凝胶颗粒脱水，并在室温下振荡孵育20分钟，直至凝胶颗粒变为白色且不透明。去除乙腈后，向每个孔中加入150 µL溶于冷碳酸氢铵中的胰蛋白酶。

将平板在37摄氏度下振荡孵育两小时。接着，将一个洁净的锥底板置于含有凝胶的平板下方，确保平板方向正确。然后，以200 × g 离心一分钟，收集含有肽段的液体。

将含有肽段的培养板放入离心浓缩仪中，在执行下一步操作的同时蒸发液体。向凝胶碎块中加入150 µL的50%乙腈、0.25%甲酸溶液。在37°C下振荡孵育30分钟。

通过在200 × g 条件下离心1分钟，将液体收集到部分干燥的板中。在进行下一步操作的同时，继续蒸发含有肽的板。将肽溶液转移至已洗涤的离心过滤板中。

在下方放置一个洁净的锥底板以收集肽段，并像之前一样对板堆进行离心。将锥底板中的液体蒸发，直至各孔完全干燥。干燥后，可用硅胶盖密封该板，并于-20 °C保存，直至按照文本方案进行质谱分析和数据分析。

此处展示的是 Mta2 及其共纯化蛋白的蓝色天然 PAGE 迁移谱图分级聚类的代表性结果，以树状图和表示蛋白强度的热图呈现。Mta2 的迁移谱图显示出两个峰，提示存在两个不同的复合物。部分 NuRD 亚基表现出相似的模式，在较低分子量组装体中丰度最高。

相比之下，其他NuRD亚基在高分子量NuRD复合物中的含量更为丰富。另一方面，Mta2相互作用蛋白Cdk2ap1仅存在于高分子量NuRD复合物中。一旦掌握，该技术可在两个半小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是需始终将所有样品和试剂置于冰上，以防止蛋白复合物解离。只要目标蛋白能够在天然条件下通过竞争性洗脱从亲和介质上被检测到，该方法即可适用于任何目标蛋白。在完成该操作后，还可进一步采用反向或连续免疫共沉淀等其他方法，以验证所鉴定出的亚复合物。