使用快速蛋白液相色谱系统亲和纯化6X-His标签蛋白

本研究旨在利用亲和层析技术纯化一种关键的DNA复制蛋白——瓣状内切酶1（flap endonuclease 1，FEN1）。这将使我们能够在可控的体外环境中研究FEN1在DNA复制与修复中的功能，从而加深对其功能及生物学作用的理解。目前有多种层析技术可用于纯化DNA结合蛋白，其中最常用的是亲和层析。

在亲和层析中，固定化金属亲和层析是纯化带组氨酸标签（His-tagged）蛋白质的最有效工具之一，因为组氨酸标签与金属离子（通常为镍或钴）之间的相互作用非常强。蛋白质纯化过程成功的两个关键因素是蛋白质得率和蛋白质纯度。根据蛋白质的预期用途，可能更倾向于获得较高的得率或更高的纯度。

我们的研究结果表明，为纯化带组氨酸标签的蛋白质选择合适的树脂，可能获得适合该蛋白质后续应用的理想结果。首先，将层析柱尽可能垂直地固定在夹具支架上。用塞子堵住每根层析柱的底部。

向每根层析柱底部加入一到两毫升起始缓冲液，以防止装柱过程中产生气泡。然后打开层析柱顶部，将10毫升每种浆液连续倒入柱中，同时用金属刮刀或玻璃棒抵住柱口边缘，以防止产生气泡。取下柱塞，并将层析柱底部连接至一段管路的一端。

将管路的另一端连接至FPLC系统的紫外检测端口。确认床层支撑外壳已插入流路适配器主体中。将流路适配器主体沿柱子顶部滑入，此时凸轮锁扣位于位置1，然后降低流路适配器。

然后将卡扣转至位置2。将管路连接至系统，并启动缓冲液流动1到2分钟，以排出管路中的空气，防止装柱过程中产生气泡。随后，将卡扣切换回位置1，平稳地将流路接头浸入缓冲液中，避免产生气泡，再将卡扣切换回位置2。

将卡扣从位置2切换到位置3后，拧紧凸轮基座和锁紧环。然后以每分钟10毫升的流速开始缓冲液流动，持续3分钟，或直至树脂充分压紧。FPLC色谱柱填装完成后，将样品环顶部的管路连接至FPLC系统上的Loop E。

将样品环底部的管路连接至FPLC系统的废液管路2（Waste 2）。然后将管路的一端插入FPLC系统的色谱柱接口，另一端放入废液瓶中。将泵A的管路插入经过滤的双蒸水中。

接下来，打开软件。点击系统控制选项卡。双击泵设置，选择系统泵进样环。

单击流速设置，将流速设定为 10 毫升每分钟。在 B 相百分比框中输入 0%。然后启动流动，用水冲洗样品环，推动滑动密封向下移动。

当滑动密封件到达样品环底部时，停止流动。然后将泵A从双蒸水中切换至起始缓冲液。将样品环顶部的管路连接至废液管2，底部管路连接至环路E。将柱端口的管路保留在废液中，并以每分钟10毫升的流速重新开始流动。

首先，装填FPLC色谱柱并准备样品环以进行样品上样。然后打开软件，双击“泵设置”并选择“手动上样环”。

现在将色谱柱接口的管路连接到流路适配器上方的管路上。拧下 Loop E 的管路并将其放入废液容器中。然后使用一个 30 毫升注射器抽取样品，并将注射器连接到进样口适配器上。

将注射器拧入进样口并注入样品，确保样品明显进入样品环。现在用色谱柱端盖堵住进样口。将样品环底部的管路连接到 Loop E 端口。

然后将泵B的管路放入洗脱缓冲液中。进入“主页”选项卡并选择“新建方法”。接着，在左侧栏选择“方法设置”选项卡。

转到柱类型下拉菜单并选择自定义。将柱体积输入为 5 mL，将运行所需的流速输入为 1 mL/min。进入单位选择界面，选择 CV（柱体积）作为方法的基本单位。

确认进样口 A 设置为缓冲液 A1，进样口 B 设置为缓冲液 B1。然后在左侧菜单中选择“方法概要”选项卡。在“平衡”部分，将平衡体积设置为 10 CV。在“样品上样”选项卡中，通过观察样品环来设定样品体积。进入“柱清洗”步骤，将清洗体积设置为 5 CV。对于洗脱过程，设置梯度体积为 14 CV，缓冲液 B 从 0% 线性增加至 100%，保存方法并开始运行。

确保组分收集器从第一管的位置开始。输入运行名称，然后点击“开始”。在上样过程中，将通向废液容器的管路切换至一个干净的烧杯中。

收集从这些管中流出的未结合蛋白，作为流穿液（flow through）并标记为 FT。运行结束后，转至“主页”选项卡并选择“打开运行”。打开运行文件以查看色谱图。在顶部菜单中选择“峰积分”以标记所获得的峰。

选择“组分”标签，以可视化含有洗脱蛋白的组分。