使用定量实时 PCR 检测大鼠腹膜中 microRNA 的表达

本实验的总体目标是成功纯化并检测大鼠腹膜中的miRNA。开始实验时，先使用4%异氟烷进行吸入麻醉。用70%乙醇喷洒大鼠腹部皮肤，并将其仰卧固定在软木板上。

接下来，使用剪刀和镊子在动物腹部的皮肤、肌肉和腹膜上做纵向切口。用镊子提起腹膜，在其上部沿膈肌下方最低肋骨处做横向切口，并在其下侧的侧腹区域使用手术剪刀进行横向切口。

接下来，使用手术剪在体壁上做纵向侧向切口，以剥离腹膜。然后在培养皿中用PBS冲洗腹膜。剪取并修整出20毫克的腹膜组织样本。

在此步骤中，取20毫克腹膜组织样本放入玻璃匀浆器中，加入700微升基于苯酚胍的裂解试剂。随后，将腹膜组织样本置于冰上，通过缓慢按压并旋转研杵的方式进行匀浆处理。

重复此过程数十次，直至腹膜样本完全溶解于基于苯酚胍的裂解试剂中。为进一步均质化，将均质后的裂解液转移至微型离心柱中的生物聚合物破碎系统，该系统置于2毫升收集管内。然后在4摄氏度条件下，以14,000 ×g离心3分钟。

接下来，将匀质化的裂解液转移至新的微量离心管中。向匀质化的裂解液中加入140 µL氯仿，并牢固盖紧管盖。随后，通过倒置混匀管子15秒。

随后，将样品在室温下孵育两到三分钟。接着，在4°C条件下，以12,000 × g离心15分钟。转移300 µL上清液至新的微量离心管中，注意不要扰动沉淀物。

加入450 µL的100%乙醇。然后通过涡旋振荡混合样品5秒。接下来，用移液器将最多700 µL的样品转移至置于2 mL收集管中的硅胶膜离心柱中，并盖紧管盖。

然后在15,000 × g条件下离心15秒。离心后，弃去收集管中的流穿液。随后向基于硅胶膜的离心柱中加入700 µL洗涤缓冲液1，严格洗涤样本，并盖上盖子。

在15,000 × g条件下离心15秒。离心后，弃去收集管中的流穿液。向基于二氧化硅膜的离心柱中加入500 µL洗涤缓冲液2，以去除任何微量的盐分，并盖上盖子。

然后在15,000 × g条件下离心15秒。离心后，弃去流出液和收集管，并重复此步骤一次。接着，将基于硅胶膜的离心柱再次在15,000 × g条件下离心1分钟。

离心后，弃去收集管及任何穿流液。将基于二氧化硅膜的离心柱放入一个新的1.5毫升收集管中。然后将25微升无RNase的水转移至柱上，并盖上管盖。

将样品在室温下放置五分钟。在15,000 ×g条件下离心一分钟。随后，将含有总RNA的25微升溶液转移至新的微量离心管中，并在使用前于-80摄氏度保存。

在此步骤中，配制一种总反应混合液，每管总量为 8 微升，其中包含 2 微升 10x 核酸混合液、2 微升逆转录酶混合液和 4 微升 5x Hispec 缓冲液。然后将 8 微升总反应混合液分装至各管中。使用分光光度计测定总 RNA 的含量。

随后，向每个试管中加入从腹膜样本中分离纯化的1微克总RNA。接着，向每个试管中加入无RNase的水，使总体积达到20微升。然后通过移液充分混匀，并离心15秒。

随后，将样品在 37 摄氏度下孵育 60 分钟，然后在 95 摄氏度下孵育 5 分钟。将新合成的 cDNA 转移至新的微量离心管中，并用无 RNase 水稀释 10 倍。

在此步骤中，为每个孔配制一份主混合液，包含12.5 µL的2× PCR主混合液、2.5 µL浓度为5 µM的miRNA引物（溶于无核酸酶水中）、以及1.25 µL的10×通用引物。将22.5 µL该主混合液加入96孔板的每个孔中。然后向每个孔加入2.5 µL的模板cDNA。

用封板膜密封96孔反应板，然后在1,000 × g条件下离心30秒。将板放入实时荧光定量PCR仪中，运行PCR扩增程序。

在实时 PCR 软件中，定义实验参数。接下来，为每个孔中的样品和目的 miRNA 分配名称。然后在实时 PCR 软件中输入 20 µL 的反应体积，并根据说明书设置以下 PCR 扩增循环条件。

95摄氏度预变性15分钟，随后进行40个循环：94摄氏度变性15秒，55摄氏度退火30秒，70摄氏度延伸30秒。根据miRNA微阵列筛选结果，采用本论文所述的QRT-PCR方案检测发现，与假手术组大鼠和对照组大鼠相比，腹膜纤维化大鼠腹膜中6种miRNA的表达水平显著升高。