在果蝇 Drosophila melanogaster 中通过免疫染色可视化类固醇生成器官及其相互作用器官的实验方案

本实验的总体目标是可视化黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫或成年雌性个体中的类固醇生成器官及其相互作用器官。该方法有助于理解昆虫类固醇激素的生物合成过程，以及调控交配行为和变态发育的神经调节机制。该技术的主要优势在于，类固醇生成器官的神经支配及其与相互作用器官之间的相对位置关系能够保持完整。

通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为果蝇幼虫的类固醇合成器官非常微小且透明。我们实验室很乐意分享我们的解剖方案。现在，让我们开始吧。

制备好幼虫后，在装有 PBS 的三厘米培养皿中，于解剖显微镜下开始进行长程解剖。首先，用镊子夹住口钩。然后，使用显微剪刀从身体前端约三分之一处将虫体剪断。

接下来，用一对镊子夹住幼虫的前端，在另一对镊子的辅助下轻轻将头部顶端推入体内，最终使幼虫体壁外翻。在10分钟内以该方法准备最多20条幼虫，随后将其转移至固定液中。30分钟后，洗涤样品，然后进行免疫染色。

首先，将幼虫浸没在水中约一小时，使其窒息从而达到固定幼虫的目的。然后，将一只幼虫背面向上放置于涂有硅胶的培养皿中的 PBS 液滴中。背侧具有两条气管。

在解剖显微镜下，使用镊子将昆虫针插入前端顶端。然后，将虫体向后端拉伸，并在后端顶端插入第二根针。接着，使用显微剪刀在尾部附近做一个小切口。

从切口处开始，沿背侧中线向头部方向纵向小心切开背侧角质层，注意不要损伤角质层下方的任何组织。完成切口后，将体壁向两侧拉开，并用昆虫针在四角固定。然后用镊子移除前部的脂肪体和唾液腺，从而将脑-环腺复合体暴露于表面。

现在，吸去 PBS，将样本浸入固定液中。30 分钟后，用镊子取下昆虫针，并将样本转移至含有 0.3% PBT 的微量离心管中。随后，进行免疫染色。

免疫染色幼虫后，使用一次性移液管将样品转移至盛有0.3% PBT的培养皿中。在解剖显微镜下，用一对镊子夹住幼虫的体壁或口钩。然后，使用连接在1毫升注射器上的27号针头，像使用刀具一样切断食道前端以及眼原基，从而将脑-环腺-眼原基复合体从体壁中分离出来。

接下来，使用镊子小心地将食道和肠道从脑-围心体-眼盘复合体上分离。将肠道拉向后方，因为食道位于腹神经索上方并穿过脑部。最后，用解剖针小心切断脑盘、眼盘与腿盘之间的连接，以分离出脑-围心体复合体。

解剖过程中使用刃口锋利的精细镊子至关重要。强烈建议您用磨石打磨镊子，使其刃口紧密贴合，无任何缝隙。转移样品时，请使用带有宽口吸头的微量移液器。

将样品置于载玻片中央。然后用镊子将样品调整至腹面朝上，以便对位于脑部背面的环腺进行成像。接着倾斜载玻片，尽可能擦去多余的PBT溶液。

然后，在样品附近滴加一滴封片剂，用镊子将盖玻片缓慢地先覆盖在封片剂上，再覆盖到样品上。为了分离成年雌性果蝇的卵巢，先用二氧化碳气体麻醉果蝇，然后切下其头部，并将其身体转移到盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的3厘米培养皿中。

接下来，在解剖显微镜下，用镊子夹住胸部的背侧，并用另一把镊子抓住第5或第6腹节（A-5或A-6）。然后，将腹部表皮向后侧剥离。操作前，需将镊子上粘附的表皮残渣清理干净。

接下来，夹住一条卵巢管，分离出卵巢。然后用镊子梳理并展开卵巢的末端。展开后，将卵巢浸入固定液中固定30分钟，以备染色使用。

为了制备保留卵巢神经支配的样本，将麻醉后的雌性果蝇转移至盛有 PBS 的硅胶包被培养皿中。在解剖显微镜下，夹住喙部并剥离头部的表皮，以暴露脑组织。从脑组织上移除附着的气管，同时保持脑与腹神经索的连接。

然后，从背侧握住胸部，去除足和翅。接着，从每条足的基部开始，剥除胸部的腹侧表皮。一旦腹神经索（VNC）暴露，需用镊子非常小心地去除附着在腹神经索上的残余背侧表皮和肌肉。

切勿损伤脑与腹神经索之间的连接。接下来，用镊子剥离腹部体壁，以暴露卵巢及其相互关联的器官，包括支撑结构、肠道、输卵管、子宫和附属腺体。最后，清除所有残留组织，包括气管和脂肪体。

然后，将样品浸入固定液中30分钟，以进行免疫染色前的准备。免疫染色后，使用微量移液器将样品转移至含有0.1%PBT的玻璃载玻片上。接着，在显微镜下观察载玻片，并用镊子将卵巢管的串状结构彼此分离。

在此过程中切勿损伤卵管末端，因其含有生殖腺。在制备脑与生殖器官复合体时，应清除任何残留的角质层，并将结构展开铺于载玻片上。

接下来，擦去大部分多余的 PBT，然后向样本上滴加一滴封片剂。接着，用镊子将盖玻片缓慢地放置在载玻片上，并将载玻片置于 4 摄氏度避光保存。随后在显微镜下观察样本，并将类固醇生成器官移入视野中。

固定视野后，将成像系统切换至图像采集模式。在幼虫阶段，使用针对蜕皮类固醇生成酶的抗体（包括抗-shroud 抗体）对前胸腺进行标记。为了观察前胸腺与脑之间的神经连接，解剖了脑-环腺复合体。

通过肌肉剥离解剖法可观察到口胃神经系统，其中一群5-羟色胺能神经元投射至前胸腺、前胃和咽部肌肉。在成年雌性个体中，卵巢蜕皮类固醇激素影响卵子发生过程的多个方面，例如生殖干细胞（GSC）的增殖。GSC位于卵巢每个卵小管末端的生殖囊中。

在卵原区中，使用两种抗体1B1和DE-cadherin特异性地标记了生殖干细胞（GSCs）。为了观察卵巢的神经支配情况，解剖了卵巢以及脑、腹神经索（VNC）、肠道、受精囊、子宫和交配囊。在n-Synaptobrevin GAL4驱动下，通过mCD8:GFP标记来可视化神经元。

此外，使用双偶联鬼笔环肽对肌肉结构进行染色。尽管类固醇生成器官的解剖最初可能较难掌握，但可通过本视频学习组织的切割位置，从而更轻松地分离器官并避免损伤。我们希望本实验方案不仅对初学者，也对有经验的研究人员具有参考价值。

一旦掌握，您便可将此方法应用于自己的研究，并根据需要进行调整。我们希望本实验方案有助于全面理解类固醇激素的生物合成过程。更详细的分步操作流程可参见相关论文。

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