体外成像与荧光标记GnRH类似物药物靶向效率的定量分析

本实验的总体目标是研究并预测基于GnRH的药物递送系统在人类癌细胞培养中的有效性。该方法有助于回答靶向抗癌治疗领域中的关键问题，例如不同人类癌症类型的细胞对GnRH靶向抗癌药物的摄取效率如何。该方法的主要优势在于使用了新型荧光标记的GnRH类似物，可同时用于共聚焦显微镜和流式细胞术分析。

该技术在抗癌治疗方面具有重要意义，因为促性腺激素释放激素（GnRH）受体在多种癌细胞类型上高度表达，从而能够实现对这些细胞的选择性靶向。本次实验操作将由我实验室的博士研究生 Bianka Gurbi 进行演示。首先，从已接种细胞的显微镜载玻片的七个孔中分别移除培养液。

然后，向阴性对照孔中加入 250 µL 预热的完全培养基，向其余六个孔中各加入 250 µL 预热的 GnRH fit 种子处理培养基。将玻片置于 37 °C、5% 二氧化碳的培养箱中孵育 5 小时。孵育 5 小时后，吸去各孔中的培养基，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。

随后，向每个孔中加入 250 µL 固定液，在室温下孵育载玻片 10 分钟。细胞固定后，弃去固定液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 用 PBS 配制的 5 µM 荧光探针溶液，在室温下孵育载玻片 10 分钟。

去除荧光探针溶液后，用 250 微升 PBS 小心洗涤细胞两次。最后，向每个孔中加入三到四滴封片介质。将载玻片置于室温避光处，直至在显微镜下观察成像。

从接种了细胞的显微镜载玻片的五个孔中移除培养基。接着，向阴性对照孔以及未处理细胞的第二个孔中各加入 250 微升预热的完全培养基。用含有 10 微摩尔 GnRH FITC 的预热处理培养基对剩余三个孔中的细胞进行预处理。

将载玻片置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育1小时。随后，仅移除处理组细胞的培养基，并用250微升预热的完全培养基洗涤细胞。接着，移除洗涤用培养基。

然后，向三个孔中每个孔加入 250 µL 预热的完全培养基。将玻片置于 37 °C、5% 二氧化碳的培养箱中孵育 1 小时。孵育结束后，弃去全部五个孔中的培养基，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。

然后，移除 PBS，并在室温下用 250 微升固定液固定细胞 10 分钟。接着，弃去固定液，用 250 微升 PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 微升封闭液，并在室温下孵育载玻片 1 小时。

除阴性对照外，吸出各孔中的封闭液。用250 µL PBS洗涤细胞后，向每孔加入250 µL一抗溶液。将玻片置于避光处，室温孵育1小时。

从五个孔中移除溶液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。然后移除 PBS，加入 250 µL 二抗溶液。将玻片在室温下避光孵育一小时。

吸出每孔中的溶液，用 250 µL PBS 洗涤细胞。去除洗涤用 PBS 后，向每孔中加入含 5 µM 荧光探针的 250 µL PBS。将玻片在室温下孵育 10 分钟。

从每个孔中移除荧光探针溶液，并用 250 微升 PBS 小心洗涤细胞两次。最后，向每个孔中加入三到四滴封片介质。将载玻片置于室温避光处，直至在显微镜下成像。

在倒置共聚焦激光扫描显微镜下观察细胞。打开 488 纳米和 633 纳米激光器。检查激光放大倍数和针孔大小。

对阴性对照样本进行成像。优化观察到的细胞核信号，并调整 FITC 和 Alexa 546 的信号，使其接近零。然后，使用相同的参数对处理后的样本进行成像。

弃去已接种的培养板中全部七个孔中的完全培养基。然后，向阴性对照孔中加入一毫升预热的完全培养基，向其余六个孔中各加入一毫升预热的处理用培养基。将培养板置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育五小时。

弃去所有孔中的培养基后，用两毫升 PBS 轻轻洗涤细胞两次。移除 PBS，然后每孔加入 500 微升胰蛋白酶 EDTA 溶液。将培养板置于 37 摄氏度孵育，直至细胞脱落，大约需要 10 分钟。

用一毫升完全培养基中和每个孔中的胰蛋白酶，并轻轻振荡培养板。随后通过轻柔吹打重悬细胞。将细胞悬液分别转移至不同的FACS管中，在4摄氏度、150 × g条件下离心4分钟。

小心地弃去上清液。然后，向每根FACS管中加入500 µL预冷的PBS，轻轻重悬细胞。将FACS管置于冰上，待FACS分析。

本文展示了促性腺激素释放激素（GnRH）在咽癌细胞中的摄取分析。使用一微摩尔的荧光标记GnRH复合物处理细胞5小时后，可在咽癌细胞中观察到微弱但可辨别的绿色荧光信号，表明GnRH被轻微摄取。进一步增加复合物剂量可导致摄取增强，证明GnRH在咽癌细胞中的摄取具有剂量依赖性。

通过同时使用荧光标记的GnRH复合物处理，并对肺癌细胞中的一型GnRH受体及细胞核进行染色，分析了GnRH的受体依赖性摄取及其配体在受体中的细胞内分布。结果显示，一型GnRH受体定位于细胞膜，而GnRH蛋白则被细胞内化并保留在细胞质中。此外，还采用流式细胞术（FACS）分析研究了咽癌细胞对GnRH的摄取情况。

结果显示，当细胞处理的GnRH偶联物剂量从1微摩尔增加到10微摩尔时，GnRH的摄取显著增强。一旦掌握该技术，若操作得当，可在八小时内完成。在进行该实验步骤时，重要的是要记住避免将处理后的样品和荧光染料暴露于直射光线下。

完成此操作后，可进一步开展细胞活力或细胞凋亡检测等其他方法，以回答更多问题，例如靶向GnRH的药物抑制特定类型癌症生长的效率如何。该技术的建立为癌症治疗领域的研究人员探索基于GnRH的药物递送系统在黏附癌细胞中的有效性奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用这些荧光标记的GnRH偶联物来研究癌细胞对GnRH靶向治疗的敏感性。