放射自显影作为一种简单而强大的药理学靶点可视化与表征方法

放射自显影是一种强大且简便的技术，可通过使用针对靶标的特异性放射性配体来研究蛋白质结合位点在组织中的分布。它也是免疫组织化学的一种合适替代方法。该技术通过数字成像实现对蛋白质表达的可视化，具有空间分辨率，且比传统的胶片曝光更快。

该方法也可用于蛋白质靶点的药理学分析。该方法涉及固定在玻璃片上的小鼠组织，但可扩展至其他物种，甚至生长在盖玻片上的细胞。本实验操作将由我实验室的博士生 Nane Griem-Krey 进行演示。

首先，将组织浸入粉末状干冰中进行速冻。随后立即将冻存的组织转移至设定为负20摄氏度的冷冻切片机中。让组织在冷冻切片机内于负20摄氏度条件下平衡20分钟。

然后在冷冻切片机外用包埋介质覆盖组织架，当包埋介质仍处于液态时，迅速将冷冻的组织样本以所需方向放入。将组织架放回冷冻切片机内，使包埋介质暴露于零下10摄氏度以下的温度中使其硬化。将组织架置于冷冻切片机的切片装置中。

调整组织的方向以避免切出倾斜的切片。根据立体定位图谱的指引，将组织切成所需厚度的切片，必要时用小刷子将切片展平。将切片贴附于载玻片上，进行解冻固定。

然后从目标区域依次收集所需技术重复的切片。将载玻片上的切片在空气中干燥一小时后再进行后续操作。在具备资质的放射性实验室中，使用铅笔在载玻片上标记实验条件。

将载玻片水平放置于塑料托盘中。小心地将适量的SA缓冲液滴加到载玻片上的组织切片，确保缓冲液覆盖目标区域。确保每个切片完全被覆盖。

为测定非特异性结合，向SA缓冲液中加入适当浓度的未标记化合物。然后用盖子盖住培养板以避免蒸发。在20 rpm转速的平板摇床中，于适当温度下预孵育30分钟。

接下来，从每张载玻片上倒掉预孵育液体，并将载玻片重新放回塑料托盘中。立即用含有适当浓度放射性配体的SA缓冲液完全覆盖组织切片。为测定非特异性结合，需在放射性配体溶液中加入适当浓度的未标记化合物。

用盖子盖住托盘，并在所需条件下以20 rpm的恒定轻柔振荡进行孵育。随后，倒掉孵育液，将载玻片转移至显微镜载玻片架中，并立即清洗载玻片。

对于GHB实验方案，先用冰冻的SA缓冲液洗涤两次，每次20秒，然后将载玻片架浸入盛有冰冻蒸馏水的托盘中漂洗两次。将载玻片垂直放置于架上，室温下自然干燥至少一小时。随后将载玻片转移至含有多聚甲醛的固定液中，在室温下固定过夜。

第二天，将载玻片转移至含有硅胶、室温条件下的干燥器中。将载玻片在干燥器中放置三小时，以去除水分。首先，将切片放入具有辐射屏蔽功能的成像板盒中，确保组织面朝上。

每个盒中均需放置一个放射性微尺，用于后续放射性配体结合的定量分析。使用前立即按照制造商说明，将对氚敏感的磷屏成像板装入磷屏成像仪，并暴露于可见红外光下以擦除背景信号。随后将成像板从磷屏成像仪中取出，立即放置于盒中的组织切片上。

确保胶片盒完全闭合。在室温下避光条件下，将切片置于磷屏成像板上，进行优化时间的曝光。曝光结束后，在暗处小心打开胶片盒，并立即将成像板转移至磷屏成像仪的暗盒中。

以尽可能高的分辨率扫描平板以获得数字图像。首先，打开合适的图像分析程序。通过选择菜单项“区域确定”，测定每个校准标准品的相对光密度。

选择区域创建工具，并用它为放射性微尺度的每个点选择相同大小的区域。通过点击菜单项“标签”下方的数字，为每个选定区域分配一个编号。点击“文件”→“导出”，然后选择“2D区域报告”，以导出校准标准每个点的光密度（OD）值。

在专有成像软件中，使用区域创建工具选择每张切片中的感兴趣区域，并测量其光密度（OD），以开始对放射自显影图像进行定量分析。通过创建感兴趣区域的模板，并将其复制后根据每张放射自显影图像中脑解剖结构的微小差异进行调整，从而在每张切片中选择相同的区域。完成此操作后，点击“文件”→“导出”→“2D区域报告”，将所选区域的相对光密度（ROD）值和面积导出至电子表格中。

根据文本方案中所述，确定放射性配体的结合情况。在本研究中，通过放射性标记的GHB类似物HOCPCA，在小鼠脑的冠状面、矢状面和水平切片中可视化高亲和力GHB结合位点的解剖分布。结果显示海马和皮层中结合水平较高，纹状体中结合水平较低，而小脑中未检测到结合信号。

如图所示，可利用不同切面观察解剖结构，并通过焦油紫染色支持解剖完整性的判断。大鼠、小鼠和猪的代表性自显影图像展示了高亲和力GHB结合位点在哺乳动物脑中的进化保守性。在上述三种物种中均检测到放射性HOCPCA结合位点，从而能够比较它们之间脑的整体解剖结构。

使用具有不同结合位点亲和力但比活度相当的GHB放射性配体来探查高亲和力GHB结合位点。放射性HOCPCA具有高灵敏度和优异的信噪比。由于放射性NCS-382的灵敏度较低，必须使用较高的放射性配体浓度才能获得相当水平的结合信号。

要达到可比较的结合水平，放射性GHB需要更高的放射性配体浓度。然而，较高的放射性配体浓度也会增加非特异性结合水平，从而导致信噪比降低。因此，优化实验条件（如放射性配体浓度、洗涤步骤和曝光时间）以获得最佳的信噪比至关重要。同时，务必记得在实验前彻底擦除检测板。

该步骤可扩展至体内条件，以了解化合物在活体动物中的结合情况，这对发现类项目可能具有重要意义。操作放射性物质或对苯二甲醛时，务必在具备完整放射性材料资质认证的实验室中进行，并穿戴防护服。