利用重组酶介导的盒式交换在小鼠胚胎干细胞中进行结构-功能研究

本结构-功能研究方法的总体目标是在分子水平上解析不同蛋白质结构域或与疾病相关的突变在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）未分化或分化状态下的作用。该方法有助于揭示蛋白质的不同残基或结构域如何在特定细胞环境中影响其功能。该技术的主要优势在于，能够高效地将拯救性表达载体靶向整合至基因敲除胚胎干细胞的基因组中，从而研究这些结构域或突变在不同类型细胞中的功能。

为此，我们结合了三种高效的技术，包括改进的小鼠胚胎干细胞分离、基于重组的靶向因子组装，以及通过重组介导的盒式交换（RMC）实现的胚胎干细胞靶向。部分实验操作将由本实验室的技术员 Jinke D'Hont 演示。

重组介导的盒式交换（RMCE）能够实现载体与基因组位点之间DNA片段的互换。RMCE利用的是嵌入基因组位点内的异特异性重组位点，这些位点彼此不发生交叉反应。当存在一个供体质粒，其携带的DNA片段两侧含有相同的异特异性位点时，由于双重同步易位的作用，重组酶会将该DNA片段插入到与RMCE兼容的基因组位点中。

只有在发生正确重组的情况下，Rosa 26 定点中被捕获的无启动子新霉素抗性基因才会通过进入的靶向载体中的 PGK 启动子得以恢复，从而赋予细胞药物抗性。这种新霉素抗性捕获系统可实现非常高的靶向效率，通常接近 100%。在进行囊胚分离的前一天，向 12 孔培养板中加入 0.1% 明胶，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。

吸去明胶溶液。然后将一管P2小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的四分之一接种到MEF培养基中，并分装至12孔板的各孔中。将含有MEFs的12孔板置于37摄氏度下，用2毫升MEF培养基进行培养。

将细胞培养至融合的单层。然后向孔中加入浓度为每毫升10微克的丝裂霉素C（Mitomycin C）。在37摄氏度下孵育培养物3小时，以使细胞失活。

根据文本方案，选择在 Rosa 26 位点携带 RMCE 基因盒的杂合子基因敲除小鼠后，将 RMCE 兼容的杂合子基因敲除小鼠与杂合子基因敲除小鼠进行交配。次日早晨，通过抓住雌鼠尾根部将其提起，检查阴道口是否有白色栓塞物，以确认交配情况。若栓塞不易观察，可用斜面探针轻轻分开阴唇，确认后将已栓塞的雌鼠与雄鼠分离。

在交配后3.5天（DPC）收集囊胚。处死怀孕雌鼠后，做腹中线切口，使用精细剪刀和镊子分离子宫和输卵管。接着，将连接在装有M2培养基的1毫升注射器上的26号针头弯成45度角。

将针头插入靠近输卵管的子宫末端。用精细镊子固定针头，同时推动针管活塞，将囊胚从子宫冲洗至10厘米培养皿的皿盖中。若冲洗成功，子宫会膨胀。

用口吸管将所有胚胎收集到一滴 M2 培养基中，并用一滴 M2 培养基洗涤胚胎两次。洗涤胚胎后，立即用 PBS 将经丝裂霉素 C 灭活的细胞洗涤两次。然后用口吸管将每个囊胚分别接种到经丝裂霉素 C 处理的 MEFs 的不同孔中，使用添加多能性因子或 2I 的 SRES 细胞培养基。

将培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。每两到三天更换一次SREF细胞培养基。在体视显微镜下以4倍放大倍数检查每个囊胚，观察其是否孵化以及是否从MEF层上脱离。

培养10至12天后，在体视显微镜下，使用带一次性吸头的P10移液器挑取单个icium外延生长物。将每个外延生长物转移至含有约10微升培养基的V型96孔板中，每孔预先加入30微升PBS。使用多通道移液器，向每孔加入50微升0.25%胰蛋白酶。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育培养板3分钟。加入100微升预先孵育的含FPS的ES细胞培养基，通过移液吹打10至15次将icium外延生长物解离为单细胞。然后将解离后的细胞转移至经丝裂霉素C处理的96孔MEF培养板中。

次日，更换基于SR的培养基。以类似方式将ES细胞从24孔板扩增至6孔板。根据正文方案鉴定出拯救型cDNA载体后，使用100纳克拯救型cDNA载体、150纳克预先切除的RMCEDV1载体以及2微升重组酶混合液（包含噬菌体编码的整合酶、切除酶和细菌整合宿主因子）制备10微升LR反应体系。

在25摄氏度下孵育反应2小时。为了转化重组载体，将每种混合物各5微升加入含有40微升热激感受态E.Coli细菌的2毫升带裙边螺口管中，并将样品置于冰上孵育20分钟。

然后将细胞在37摄氏度下孵育5分钟。向离心管中加入1毫升LB培养基，并将细胞在37摄氏度下孵育1小时。取50微升菌液涂布于含氨苄青霉素的琼脂平板上。

在37摄氏度下过夜培养。使用P200枪头随机挑取五个菌落，通过菌落鉴定确认含有正确靶向载体的克隆。将枪头转移至含有2至5毫升LB培养基的玻璃试管中，在37摄氏度下过夜培养。

从每个菌落中提取DNA后，取0.5至2微克DNA进行酶切消化，以验证样品，并在1%琼脂糖凝胶上分离样品。开始培养适用于RMCE的基因敲除ES细胞，并在含FBS的ES细胞培养基中于MEF上至少传代两次。然后将ES细胞接种至明胶包被的六孔板中进行分盘。

次日，使用 1.5 毫升基于 FBS 的 ES 细胞培养基，更换约 50% 汇合度的 ES 细胞培养液。在 250 微升纯 DMEM 培养基中，加入 1 微克预先切除的 RMCEDV1 靶向载体（包含救援用 cDNA）和 1 微克 FLIPe 表达质粒。另取 250 微升纯 DMEM 培养基，加入 7 微升基于脂质体转染试剂（lipofectin-based transfection reagent）。

在室温下孵育溶液5分钟。将DNA与脂质体转染试剂（Lipofectin）溶液混合，并在室温下孵育混合物20分钟。

然后将转染混合物用移液器加入复苏后的ES细胞中，轻轻混匀。转染后一天，将所有ES细胞从离心管转移至含有一层汇合的DR4 MEFS细胞和10毫升基于FPS的ES细胞培养基的10厘米培养皿中。转染后两天，通过向培养基中添加G418，筛选发生正确FLIP-e介导的盒式交换的ES细胞克隆。

如图所示，非靶向菌落在3至5天后应可见大量死亡。菌落应在7至10天后出现。挑取这些菌落，随后进行扩增，并按照本视频前面演示的方法验证克隆。

为了将ES细胞分化为类胚体（EB），在根据文本方案用Rosa 26驱动的拯救构建体培养敲除ES细胞后，将细胞置于非黏附培养皿中形成EB，持续培养30天。每两到三天更换一次培养基，方法是将EB悬液转移至50毫升离心管中，静置使EB依靠重力自然沉降。

吸去上清液，加入新鲜培养基，将拟胚体（EB）悬浮液转移至细菌级培养皿中。根据文本方案，通过免疫荧光和透射电子显微镜（TEM）对胚胎干细胞（ES细胞）和拟胚体进行分析。采用结构功能法，成功构建了五种预先切除的RMCEDV1靶向载体，构建效率为100%；这些拯救型载体通过RMCE技术靶向整合至P120连环蛋白基因敲除的ES细胞中，靶向效率达97%。囊状EB的形态可作为表型读出指标，用于筛选不同的拯救型构建体。

作为概念验证，由 R26 驱动的 P120 连环蛋白同工型 1A 挽救了 p120 连环蛋白敲除表型。为了检测 P120 连环蛋白在不依赖 E-钙黏蛋白的情况下是否能够实现膜锚定并促进拟胚体（EB）形成，将 K-ras 膜定位基序 CAAX 融合至 P120 连环蛋白的羧基末端，并通过 RMCE 技术将其引入 P120 连环蛋白敲除的胚胎干细胞中，随后由这些细胞生成拟胚体。然而，该构建体具有显性负性作用，无法介导 E-钙黏蛋白的结合与稳定。

因此，无法挽救p120连环蛋白敲除表型。上皮-间充质转化（EMT）是一种重要的发育过程，在胚胎干细胞分化过程中也会发生。当在p120连环蛋白敲除的胚胎干细胞中表达EMT诱导因子ZEB1、ZEB2或snail时，这些因子虽可直接抑制多种上皮标志基因（如E-钙黏蛋白），但未能恢复囊状胚体的形成。

一旦掌握，可在一个月内分离出适用于RMCE的ES细胞。RMCE兼容的靶向载体可在一周内构建完成，若操作得当，利用该技术可在一个月内实现ES细胞的靶向拯救。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用RMCE在未分化或已分化的胚胎干细胞中开展结构与功能研究。