通过AAVS1位点的重组酶介导的盒式交换快速高效地生成重组人多能干细胞

本实验的主要目标是利用翻转酶介导的盒式交换技术（RMCE），在人类多能干细胞（human PSCs）的AAVS1位点中快速高效地进行靶向基因组编辑。RMCE可提高外源序列在AAVS1位点的靶向插入效率，这在干细胞生物学研究中具有重要意义，因为它能够通过过表达或基因敲低手段快速验证分子功能。该技术的主要优势在于，仅需15天即可获得无随机整合事件、仍保持多能性且核型正常的新型人类PSC细胞系。

该方法为在 AAVS1 位点进行转基因操作提供了有用的工具，但也可应用于其他人源许可位点。首先，在六孔板中按照标准操作，在灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）上或无饲养层条件下培养人多能干细胞主细胞系。当细胞达到 60% 至 70% 汇合度时，开始铺入耐药性 iMEFs，首先使用 0.1% 明胶溶液包被 12 孔板所需的孔，室温孵育五分钟。

然后，每孔接种125,000个iDR4细胞，并用iMEF培养基过夜培养。次日，将人源PSC培养物用含有10微摩尔ROCK抑制剂的新鲜培养基在37摄氏度预孵育1小时。与此同时，将人源ESC转染溶液和细胞解离试剂恢复至室温。

每种核转染条件准备一毫升核转染铺板培养基。然后，从孔中移除iDR4培养基，用一毫升室温PBS洗涤细胞，并加入核转染铺板培养基。将每份样品500微升的铺板培养基转移至无菌的1.5毫升离心管中，于37°C保存，直至进行铺板。

为了将人多能干细胞（PSCs）解离为单细胞悬液，首先移除培养基，用室温的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后分别向饲养层或无饲养层培养的人PSC中加入1毫升0.05%胰蛋白酶或Accutase。将培养物置于37摄氏度孵育。随后，小心地从孵箱中取出培养板，在细胞尚未解离前，吸除消化试剂，并加入1毫升人PSC培养基。

通过轻柔地将培养基冲洗至培养皿表面，使松散的细胞解离，同时避免产生气泡。将细胞收集至洁净无菌的15或50毫升离心管中，形成单细胞悬液。随后用1毫升hESC培养基洗涤细胞，并收集至同一离心管中。

取50微升细胞悬液用于计数，将剩余细胞在室温下以300 × g离心5分钟。在细胞悬液离心的同时，使用细胞计数仪进行细胞计数。弃去上清液，加入室温的PBS，轻轻重悬细胞沉淀，使细胞浓度为每毫升10的6次方个细胞。

然后，将每个实验条件下两毫升样品转移至洁净的无菌15毫升离心管中，并重复离心操作。在样品离心的同时，在三个洁净的1.5毫升离心管中配制质粒混合物，分别使用0:1、2:1和2:0的供体质粒与flippase分子比例，每管加入2.5微克flippase质粒。为进行核转染，从培养箱中取出iDR4培养板以及含有铺板培养基的1.5毫升离心管。

一次取一个离心管，不要扰动沉淀，小心地用移液器吸去PBS，尽可能去除缓冲液。用100微升转染溶液通过轻柔吹打重悬沉淀。然后将细胞悬液转移至含有质粒混合物的1.5毫升离心管中，轻轻混匀。

将细胞DNA混合物转移至电转杯中，注意避免产生气泡。将电转杯插入核转染仪中，对饲养层培养的细胞运行程序A13，或对无饲养层的细胞运行程序F16。取出电转杯后，使用试剂盒中的一次性转移移液管，轻柔但迅速地一次性加入0.5毫升铺板培养基。

然后，以相同方式回收体积，并将细胞悬液逐滴加入含有iDR4和铺板培养基的12孔板中。将培养皿放入培养箱的架子上，缓慢前后及左右移动，使细胞悬液均匀分布。更换培养基前，先将培养皿孵育24小时。

转染后两到三天开始筛选。吸除培养基，用1毫升PBS洗涤细胞，然后加入含有100纳克/毫升嘌呤霉素的人类胚胎干细胞培养基。观察细胞生长情况，并根据需要逐步提高嘌呤霉素浓度，最高至250纳克/毫升，持续进行嘌呤霉素筛选七天。

在嘌呤霉素筛选3至4天后，开始使用0.5微摩尔的氟尿苷（fialuridine）或FIAU进行筛选。每天更换培养基，FIAU处理时间不超过连续7天。筛选完成后，约第14至15天，将出现耐药的RMCE克隆，即构成新的RMCE细胞系。

按照标准操作以1:2的比例对细胞进行传代。当关键步骤1中的孔准备传代时，将用于表征的孔按照视频前面所述方法解离为单细胞悬液，并将细胞收集至15毫升离心管中。在室温下以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。

然后，用一毫升 PBS 重悬细胞，并将样品分为两份：一份经细胞滤网过滤后用于流式细胞术分析，另一份根据文本方案用于 DNA 分析。在转染 flippase 重组酶和 tdT RMCE 供体质粒后，hPSCs 在 iDR4 MEF 层上形成均匀分布的小细胞簇，并表达组成型 GFP 和瞬时 tdT。

使用嘌呤霉素进行阳性筛选有利于RMCE供体质粒的插入，随后使用FIAU进行阴性筛选，以获得仅由FRT介导且不含有TK基因的重组事件。转染后约第六天，可观察到少量RMCE GFP阴性、tdT阳性细胞的小簇。如本实验所示，仅当同时使用RMCE供体质粒和Flippase时，才会出现GFP阴性、tdT阳性的RMCE克隆；而在缺乏Flippase的情况下则不会发生RMCE。对新建立的RMCE细胞系（即嘌呤霉素和FIAU抗性的RMCE克隆）进行流式细胞术分析，将其混合形成非克隆性细胞群体后进一步验证，结果显示100%的细胞均表现为RMCE GFP阴性、tdT阳性的表型。

当使用在hPSC中无记录活性的RMCE供体时，100%的细胞GFP呈阴性。此处展示的非克隆性RMCE细胞系的PCR鉴定结果表明，已实现完整的盒式元件交换，并且所用筛选程序可产生既无随机整合的RMCE供体，也无翻转酶表达载体的细胞系。总之，与靶向核酸酶方法相比，该RMCE方法显著简化了人多能干细胞（hPSC）在特定基因座上的基因编辑。

一旦掌握，该技术可在15天内完成。因此，RMCE是一种非常快速的基因编辑工具，能够在同基因背景下实现比较研究。使用该操作流程时，重要的是要确保转染效率高于30%，并预先进行适当的核心储存筛选剂处理。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何在人多能干细胞（PSCs）的AAVS1位点进行RMCE操作，以及如何对重组细胞系进行表征。