受解剖结构启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建、调控与建模

本方案描述了微组织工程神经网络（micro-TENNs）的制备方法，micro-TENNs 是一种微型三维结构，由管状水凝胶腔内跨越离散神经元群体的长轴突束组成。micro-TENNs 模拟了脑连接组在系统层面的一般解剖结构，特别是通过长轴突束连接的功能相似的神经元群。由于其预先培养以模拟脑通路的细胞架构，micro-TENNs 可用于因创伤或神经退行性疾病导致的神经环路缺失的靶向重建，也可作为神经生物学研究的生物保真模型。

该实验方案最具挑战性的方面之一是处理微米级的尺寸规格，而这对于实现微创脑部递送至关重要。首先，手动将玻璃毛细管折断为 2 至 2.5 厘米长的片段，并将一根针灸针插入每个片段中。将 1 毫升 3% 的琼脂糖溶液转移至空培养皿表面。

将毛细管插入已准备好的针头中，使毛细管一端接触液态琼脂糖液滴，通过毛细作用使液体充满毛细管。当液体停止上升时，将毛细管从液滴中取出，并水平放置于培养皿表面。接着，用拇指和食指分别从毛细管两侧捏紧固定。

用另一只手快速拔出针头，同时用拇指和食指固定微柱，防止其随针头滑出管外。然后将一根30号针头插入毛细管中，缓慢将微柱推出至含有DPBS的培养皿中。使用精细镊子小心地将一根微柱从DPBS转移至另一个空培养皿中。

用微量移液器向微柱顶部加入 10 微升 DPBS，以防止干燥。在体视显微镜下操作时，使用微型手术刀切割微柱，将其缩短至所需长度。然后用精细镊子将修整后的微柱转移至另一个含有 DPBS 的培养皿中。

在超净工作台中，将含有 DPBS 的培养皿内的微柱在紫外线下灭菌 30 分钟。使用钻头在直径 10 厘米培养皿的盖子上穿刺 16 个孔，形成边长为 4 厘米的 4×4 阵列，孔间距为 1 厘米。在化学通风橱内，使用培养皿的底部称取 27 克 PDMS 和 3 克固化剂。

使用微型刮刀搅拌，使试剂均匀分布。然后用带孔的盖子盖住PDMS固化剂。将一根软管的一端连接到通风橱的真空口，另一端插入适当大小漏斗的茎部。

将1毫升移液器吸头安装到1毫升移液球上，插入软管中，并向上拉动软管，直至移液球将软管密封在漏斗茎部。接着，将漏斗放置在已穿孔的培养皿盖上，并用可用的稳固支架固定软管。打开真空阀抽吸五分钟，使气泡上升至液面。

五分钟后，关闭阀门，取下漏斗，并将培养皿在通风橱表面轻敲数次，以消除残留的气泡。将一个3D打印的锥形孔模具放入12孔细胞培养板的每个孔中，确保锥体朝上。然后将PDMS固化剂倒入模具上方，直至填满培养板的每个孔。

将盖好的培养板放入60摄氏度的烘箱中干燥一小时。将PDMS阵列经高压灭菌后，在生物安全柜中操作，将每个微孔阵列插入一个无菌的12孔板的孔中。为形成神经元聚集体，使用移液器向PDMS阵列的每个微孔中加入12 µL细胞悬液。

将培养板在200 × g条件下离心5分钟，使细胞聚集到微孔底部。然后小心地向每个PDMS阵列顶部加入约2毫升培养基，以覆盖所有接种的微孔。将培养板置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育12至24小时。

开始CEM核心制备时，在微量离心管中混合I型胶原蛋白、层粘连蛋白和培养基，并将pH值调节至7.2至7.4。然后将装有CEM的离心管置于冰上。使用无菌镊子将微柱转移至空的35或60毫米培养皿中。

然后，在体视显微镜下操作，使用连接在1000微升枪头上的10微升枪头吸出管腔内残留的DPBS和气泡。迅速用微量移液器吸取四到五微升CEM，将移液器枪头置于微柱的一端，挤出足够的CEM以充满管腔。为防止脱水，在每个微柱周围各加入两微升CEM。

将水凝胶CEM微柱置于培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育15分钟。孵育结束后立即进行细胞接种。向含有微柱的培养皿中的两个空白区域各转移约10至20微升培养基。

使用微量移液器单独收集神经元聚集体，并将其转移至含有构建物的培养皿中。用镊子将聚集体移至培养基的小液滴中，以维持细胞活性。在体视显微镜下观察，用镊子将聚集体插入微柱的一端，用于构建单向微神经束；若构建双向结构，则在微柱的两端均插入聚集体。

然后将带有细胞的微柱转移至另一小池培养基中，以避免脱水并维持类器官的健康状态。当所有微柱加载完毕后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育45分钟，使类器官贴附于CEM上。孵育结束后，使用体视显微镜检查确认类器官是否仍位于微柱末端。

最后，使用移液管小心地将培养基加入含有微尺度组织工程神经网络（micro-TENNs）的培养皿中。将培养皿置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中进行长期培养。这些相差显微图像显示了体外培养长达八天的单向2毫升长微尺度组织工程神经网络。

在这些图像中，注意神经元聚集体位于微柱的两端，而排列整齐的轴突束则跨越管腔延伸。如图所示，在体外培养5天时，轴突束已几乎延伸贯穿整个微柱长度。对于5毫米长的双向微型组织工程神经网络（micro-TENNs），在体外培养5天时轴突束已布满微柱全长，且该结构至少可维持至体外培养10天。

以下两张图片有助于解决实验过程中可能出现的问题。此图片显示了由于在制备过程中完全去除了DPBS、CEM或培养基，或其发生蒸发，导致水凝胶微柱完全脱水干燥。此图片显示了由于针灸针与毛细管未保持同心对齐，微柱的管腔紧贴外壁。

最后，这幅共聚焦图像显示了一个体外培养28天的双向微神经组织（micro-TENN），细胞核用Hoechst染成蓝色，轴突用tudge one标记为红色，突触前小泡用synapsin 1标记为绿色。如预期所示，可见细胞从神经球沿轴突通路迁移，并伴随突触前终末的存在。微神经组织是一种自包含的、受解剖结构启发的构建物，可模拟连接组细胞结构的关键特征；因此，微神经组织在植入大脑后可能为替代丧失的神经通路提供一种手段。

该方法的关键组成部分包括管状生物材料封装方案，该方案可支持轴突的纵向生长，以及聚集体方法，该方法可确保获得适当的细胞体胞架构，使细胞体局限于管腔内部轴突束的两端。掌握这些方法后，可根据特定应用，将该技术的原理应用于构建含有其他细胞表型和生物材料组分的微型组织工程神经（micro-TENNs）。