三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

本方案旨在指导在微米级水凝胶微柱内构建自组装的、纵向排列的星形胶质细胞胞体及其突起的三维束状结构，可用于体外神经生物学模型或神经再生治疗。由于中枢神经系统内存在抑制性微环境，神经再生能力受限，因此创伤和神经退行性疾病对患者尤为有害。工程化的星形胶质细胞束通过模拟关键的神经解剖学特征以及胶质细胞介导的发育机制，克服了当前治疗策略的局限性，促进靶向性细胞迁移和轴突导向。

这些星形胶质细胞支架的结构主要受到嗅束迁移流中胶质管内排列有序的星形胶质细胞突起的启发。首先，在无菌烧杯中配制3%（质量/体积）的琼脂糖溶液和DPBS。持续加热并搅拌，以防止溶液过早凝固。

将一根针灸针插入球形分配器底部的开口中。将毛细管套在暴露的针头上，并通过将部分毛细管插入球形分配器筒体的橡胶部分来固定两者。盖上筒体盖子，完成组装。

将一毫升液体琼脂糖转移至一个空的培养皿表面。捏住球形滴管的橡胶帽，将毛细管的一端插入琼脂糖中，然后松开橡胶帽上的压力，使琼脂糖吸入毛细管内。将滴管、毛细管和针头组件放置在培养皿上，静置5分钟，使琼脂糖在毛细管内凝固。

然后将针头从毛细管中抽出，使微柱仍套在针头周围。用镊子尖端将微柱轻推至针头末端，随后将针头悬于盛有DPBS的开放培养皿上方，将微柱推入DPBS中。为制备便于后续操作这些结构的微柱船，首先配制4%（重量/体积）的琼脂糖溶液，并持续加热搅拌以保持溶液温度。

使用镊子将微柱转移至一个空的培养皿中。然后在体视显微镜下，用微型手术刀将微柱修剪至所需长度，末端切成45度角。修剪完另外三根微柱后，将四根微柱平行排列。

用移液器吸取50微升4%琼脂糖溶液，将液体沿微柱阵列划线，以连接并捆束结构形成“小船”状。静置1至2分钟，使4%琼脂糖凝固。然后用精细镊子夹住连接用的琼脂糖桥，提起微柱“小船”。

将其转移至含有DPBS的培养皿中。将微型柱船转移至生物安全柜中，并用紫外光照射30分钟进行消毒。在生物安全柜内，用共培养基配制浓度为1毫克/毫升的大鼠尾部I型胶原溶液。

然后将其置于冰上。根据需要使用酸或碱调节细胞外基质（ECM）溶液的pH值，直至pH稳定在7.2至7.4范围内。用镊子将微型柱状载具转移至35或60 mL的培养皿中。

在体视显微镜引导下，将移液器的10 mL吸头置于每个微柱的一端，吸出腔内的DPBS溶液和气泡。用P10移液器吸取胶原溶液，将10 mL吸头紧贴每个微柱的一端，注入足够溶液以充满管腔。

然后在微柱的两端分别用移液器加入基质胶（ECM）。所有微柱填充完毕后，用移液器在培养皿周围加入共培养基质，形成环状，以防止微柱干燥。将含有微柱的培养皿置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育至少一小时，以促进胶原蛋白聚合，然后再加入细胞。

随后，将 P10 移液器的吸头置于微柱的一端，转移约 5 mL 细胞悬液至微柱腔内以充满其内部。将所有微柱安装到载具后，于 37°C 及 5% 二氧化碳条件下孵育 1 小时，以促进星形胶质细胞与细胞外基质（ECM）的黏附。孵育结束后，小心向含有已固定微柱的培养皿中加入共培养培养基，35 mm 或 60 mm 培养皿分别加入 3 mL 或 6 mL。

将接种的微柱结构置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养，以促进星形胶质细胞束的自组装，通常在6至10小时后形成束状、类似电缆的结构。接种后1小时，星形胶质细胞呈球形，并分散于整个构建体中。接种后5小时，星形胶质细胞开始伸出突起并发生收缩。

接种后8小时，星形胶质细胞已发生排列并收缩。接种后24小时，在此示例中已形成致密的星形胶质细胞突起束。接种后24小时完全形成的星形胶质细胞束显示出拉链效应，即细胞束的末端连接到管腔壁的两个不同末端。

本视频展示了铺板后3至10小时的成束现象。对星形胶质细胞支架进行免疫标记，显示星形胶质细胞突起呈纵向排列。此共聚焦图像显示了一束星形胶质细胞，其中检测了星形胶质细胞标志物GFAP。

细胞核呈蓝色。该束状结构的更高倍放大图像可清晰显示微柱内星形胶质细胞的细胞架构。观看本视频后，您应能够制备出由纵向排列的星形胶质细胞束构成的活体支架，其细胞架构仿生设计，并被包裹于生物材料外壳之中。

通过该操作步骤，可设计一种移植策略，将星形胶质细胞束（无论是否包裹生物材料）递送至受损脑组织，以促进神经发生区域的定向细胞迁移，并引导细胞克服中枢神经系统微环境的限制性作用。此外，该技术还可拓展为一种高保真胶质细胞介导的神经生物学现象研究平台，其优势在于能够模拟天然的三维环境，同时保留体外系统固有的实验可控性。