MRC分子生物学实验室大分子结晶的自动化方案

本实验的总体目标是从初步结晶筛选条件出发，获得高质量的晶体。这些晶体可用于研究蛋白质、DNA、RNA及其复合物的结构。关于大分子结构的研究正变得日益具有挑战性。

提供多种初始条件可提高有用晶体的产出率，同时减少样品和晶体优化的需求。LMB 的两个全自动系统可实现最多 1,920 个纳升液滴的蒸汽扩散实验的制备。为简洁起见，本文假设用户已熟悉纳升分配仪、喷墨打印机和粘性板封膜机的基本操作与维护。

在执行程序之前，确保系统的机器人已初始化，并且其控制软件已打开。在主程序启动前约30分钟，打开管冷却载体的制冷机。将一块测试板放置在板封膜机的电动SBS载体上。

运行封板仪，并检查封膜是否正确贴合。重复此测试两次，以确认封板仪已准备就绪。然后向液体处理系统的主容器中加入 20 升去离子水。

断开连接插件与盛有20%乙醇冲洗液的小容器，将插件连接至主容器。在喷墨打印机的触摸屏上输入相应的屏幕名称，然后打开并关闭转盘门以触发转盘旋转。

当第一个堆栈出现时打开门。将第一个堆栈完全装入22块结晶板，每块板的第一列朝外。以相同方式完全装入接下来的两个堆栈。

将剩余的六块板加载到第四层堆叠的最高位置，然后关闭转盘门。确认冷却器显示屏显示为14摄氏度。轻轻并反复倒置选定的筛选试剂盒，持续1分钟。

然后，打开液体处理仪的前部面板。打开试管，将其按照标准的96孔板布局放入冷却载体中。每将一个试管放入载体时，将其管盖以相同的96孔板布局放置在托盘上。

使用系统1时，需将标签引线按96孔板布局放置在托盘上，以便核对试管是否排列正确。核对试管位置后，确保所有试管均处于水平并已稳固地放入载体中，然后关闭前面板。

在液体处理仪软件的启动窗口中，选择“运行维护”并打开“冲洗”程序。运行该程序以将系统中的20%乙醇冲洗干净，并清洗液体分配吸头的外部。冲洗完成后，单击“取消”返回启动界面。

选择“运行现有流程”，然后单击“开始选择”。打开 MRC 试剂盒分液程序。在配置界面中填写实例数量为 18，然后运行程序。在前四块板被标记、填充和密封时，监控系统运行情况。

在完成前四块板的制备之前，不得让系统无人看管。待所有72块板均制备完毕并放回转盘后，将耦合接头从去离子水容器切换至20%乙醇容器。使用与之前相同的流程运行启动冲洗程序。

关闭制冷机并丢弃空的筛选试剂盒管。小心地从转盘上取下72块已准备好的培养板。丢弃填充错误或密封不良的培养板。

将即用型酶标板储存于 10 摄氏度。首先确保系统的机器人已开启，纳升级分液器已初始化且其软件已打开，液体处理设备的方法管理器也已打开。在主程序启动前约 15 分钟打开微量管冷却载具。

将测试板放置在板封膜仪的电动SBS载板架上。运行板封膜仪，并确认板已正确封膜。重复测试板封膜仪三次。

然后运行纳升级分液器，在检测板中加入100纳升的测试溶液液滴。图中所示为纳升级分液器使用红色染料配制的测试溶液产生的100纳升液滴的光学显微图像。关闭纳升级分液器软件，并从仪器平台取下条带架模块。

接下来，将一个预先装填好的96孔结晶板放入定制的板架中，该结晶板的条件中含有最高相对量的挥发性试剂。移除板上的粘性封膜。打开液体处理仪的前面板，将未密封的板放置在第一个滑动载台后部的台面上。

用 SBS 铝盖盖住板。通过轻轻按压盖子的对角，将盖子向载体的后左角位置固定。使用 System 2 时，应优先处理含有大量挥发性试剂的筛选试剂盒。

这可以避免在SBS引物上形成冷凝水，否则可能影响引物的自动化操作或板密封。打开密封后，将引物装入滑动载体中，并以相同方式处理剩余的19块板，操作顺序从挥发性最强到最弱的条件依次进行。当微型管冷却载体温度达到4摄氏度（由绿灯指示）时，取下其盖子。

剪切掉含有至少440微升蛋白样品的微量离心管的管盖。确保样品液面无泡沫，因为泡沫会干扰液体检测系统。将该管置于微量离心管冷却载体的1号位置。

将 PCR 板放置在液体处理仪工作台面上的板移动适配器载具前方，然后关闭前面板。在液体处理仪的方法管理界面中，选择“设置板”。

监测两个系统的初始化过程，并填写运行参数，包括板的类型、每种条件下液滴的数量、液滴体积、待处理第一块板的位置以及板的数量。当提示是否需要帮助加载甲板时，点击“否”。确认无空的吸头架后，点击“确定”。确认运行所需的吸头数量充足后，点击“确定”。必要时，更新吸头管理系统，然后点击“确定”。确保纳升级分液仪甲板上无条带支架模块，并且载体位于50微升吸头堆栈后方，远离铝制SBS盖。

仔细检查所有其他必需组件是否已准备就绪，然后启动流程。在纳升级分液器将液滴分配至第一块板、随后由板封膜机密封板的过程中，需密切监控系统。在第一块板的制备完成之前，不得让系统无人看管。

当所有 20 块板均制备好结晶液滴并自动返回滑动载体后，打开前面板，轻轻取出这些板。在将板存放以进行结晶之前，检查其密封是否正确。使用 20% 乙醇溶液清洁 SBS 盖，然后将其堆叠在液体处理仪左侧以备储存。

弃去 PCR 板和微量离心管。关闭微量离心管冷却装置，并擦去冷凝水。在冷却表面放置一张纸巾，以吸收后续产生的冷凝水。

然后更换载体盖并关闭前面板。OmpF 和 MreB 最初是使用这些完全自动化的方案进行筛选的。在 LMB 7 板的 A4 孔中发现了适合 X 射线衍射的高质量 OmpF 晶体。

MreB 的衍射级晶体在 LMB 20 板的 D12 孔中被发现。将预置试剂板储存于 10 摄氏度是一种折中方案，可避免结冰，同时避免 4 摄氏度储存可能引起的结晶条件恶化及冷凝相关问题。以这种方式储存时，试剂板可在四到五个月内使用。

每年使用系统1生产4,000至8,000块LMB平板，用于初步筛选。当预期通量显著较低时，应相应调整优化方案。我们通常将全部预制燃料平板作为一个大规模的初始筛选，用于新型样本的检测。

然而，可根据更具体的样品需求选择较少的培养板。制备液滴后，将培养板存放于低振动的架子上，并将温度严格控制在 4 或 18 摄氏度。实验通过扫描光源显微镜进行评估。

在仔细研究晶体的性质后，可利用基于网络的工具（如 LMB 或 C6 Screen 数据库）分析不同条件下的特征及相似性。后续可能仍需对结晶条件进行优化。更多自动化实验方案，包括四角法和添加剂筛选，已在我们的论文中详细描述。