使用机器人在脂质介相中进行膜蛋白的高通量结晶

您好，欢迎来到膜结构与功能生物学研究组。我是 Martin Caffery。这是 JoVE 关于利用介晶或脂质立方相方法对膜蛋白进行结晶以进行结构测定的系列文章之一。

在第一篇文章 JoVE 1 7 1 2 中，我们展示了如何制备富含蛋白质的立方相，以及如何手动将黏稠且具有黏性的中间相分配到玻璃三明治板中进行结晶试验。本视频文章将介绍使用原位中间相结晶机器人的方法。机器人具有速度快、准确性高、精密度好、可微型化操作，并能在黑暗或低温等不适条件下长时间连续工作的优势。

若使用得当，机器人可显著提升膜蛋白结构与功能研究的生产力。在本视频文章中，我们展示了三种市售机器人的使用方法。第一种机器人由膜结构与功能生物学研究组开发，其详细描述见参考文献一。

另外两种最近才开始提供，此处包含它们是为了完整性。准备用于机器人进行结晶实验的结晶板时，首先需要制备玻璃三明治式结晶板的底板；关于底板的详细描述见参考文献。底板必须先进行硅烷化处理，然后将形成孔穴的带孔双面粘连垫片贴附到板上。所需的材料如下所示。

它们包括一块玻璃结晶底板、一个带孔的双面胶间隔片、用于铺展溶液的滚轮或压延纸巾，以及一杯超纯水。将底板放置在实验台面上的纸巾上。滴加数滴沉默溶液，然后用纸巾将其均匀地铺展在底板表面。

通过将培养板完全浸入盛有水的烧杯中，洗去多余的硅化溶液。将培养板从烧杯中取出后，置于干燥的纸巾上，硅化面朝上，用纸巾轻轻擦拭其暴露的表面以使其干燥。

接着，移除穿孔双面胶间隔垫上的保护盖，并将该间隔垫贴合到玻璃板的硅化表面。必须确保间隔垫在底板上正确放置，使间隔垫的左上角及其相邻的两个边与底板的对应边完全对齐。使用滚轮或压平辊将间隔垫在底板上压平，以确保二者之间形成紧密的密封。

顺便指出，如参考文献部分所述，带孔隔片的独立板可从商业途径获得。在制备完结晶基础板后，接下来我们将进行原位微晶机器人（in meso robot）的设置与使用。如下文所述，我们将展示三种原位微晶机器人的使用方法。

在所有展示的情况下，机器人都设置并使用于温度受控的房间中，meso robot one（本视频中演示的第一台 meso 机器人）的温度设定为 20 摄氏度。该设备由 PI 的实验室开发，现已有商业化产品。完整详细信息可参见参考文献部分。

此处展示了使用机器人设置结晶试验所需的材料和设备。它们包括实验记录本、含有蛋白质的溶液（按 JoVE 文章 1 7 1 2 中所述方法新鲜制备）并装于 Hamilton 注射器中、硅化底板及垫片、配套的盖玻片、水瓶和擦拭纸，以及 In Miso 机器人。

第一个画面显示的是工作台面洁净的机器人。下一个画面显示的是配备有加湿器停靠站、结晶基础板以及含有沉淀剂溶液的深孔板的完整机器人。我们首先将基础板放置在机器人的工作台面上，开始进行设置。

它拥有独立的平台，平台上有明确标记的孔位，用于底板对齐。该板应清晰标记以用于识别。含有沉淀剂溶液的96孔板固定在机器人甲板上紧邻结晶板的独立平台中。

通过小心地剥离模块的塑料顶盖来打开模块。将加湿器的湿气流引导至流经机器人平台上的底板。按照制造商的说明对机器人进行初始化设置。

此处不再详细演示该过程，因为具体的实验方案会随时间而变化。初始化过程的基本原理是：为机器人上的试剂分配臂提供三个正交方向（X、Y 和 Z）的参考位置。接下来，将装有含蛋白质的介相（meza phase）且配备分配针头的 Hamilton 注射器连接至机器人的 1 号机械臂。有关介相和注射器制备的完整细节，详见 JoVE 文章 1 7 1 2 及参考文献一。此时，分配注射器的针尖必须与结晶板左上角最上方的孔位底部及中心对齐，该孔位标识为 A1，首要任务是与 A1 孔的底部对齐。

通过在观察针尖接近孔底部的程度的同时，调节加样臂的Z坐标高度来实现。当针尖刚好接触孔底部时，可通过手动轻轻左右移动平台上的板，同时微调加样臂的高度来判断；当针尖接触板面时的加样臂Z坐标位置将被输入计算机，加样程序将设定为在针尖距离该参考Z位置数微米处进行，该位置对应于底板表面。随后启动机器人，根据用户提示执行一系列步骤，将针尖定位至A1孔的中心位置。

分配臂的参考 XY 坐标（即吸头中心位置）存储在控制机器人的计算机中，用于定义板上其余各孔的中心位置。在计算机中设置好这些参考坐标后，指令测量分配臂返回起始位置，对注射器进行预充。

现在必须对分配用注射器进行预润。这是为了确保新鲜的mease充满分配针头，并使板上的第一个孔获得足量的mease。程序中设有启动机器人运行的预润指令。

在用户控制下，这会驱动注射器中的活塞逐步前进。在此过程中，检查针尖是否有测量相（mease）伸出，随后用纸巾清除挤出的测量相（meza）。至此完成机器人运行前的预灌注过程。

机器人现在已准备好以自动模式启动运行。机器人XAP程序将启动一轮冲洗步骤，此时机器人二号机械臂上的沉淀剂分配吸头将被清洗，并准备从深孔板中吸取沉淀剂溶液。激活机器人的分配功能后，将按顺序向孔板中依次加载含蛋白质的母液，每次加载前八个孔，随后加入沉淀剂溶液。母液分配臂在每次分配后返回停放位置，此时针头末端置于湿润的海绵中，以防止尖端处的母液干燥。

最常用的膜结构与功能生物学组膜蛋白结晶实验条件为：50 纳升的蛋白溶液和 800 纳升的沉淀剂溶液。本次演示中运行机器人的程序已设定为两个机械臂同时移动。

通过这种方法，可在五分钟内完成一块96孔板的蛋白质溶液和沉淀剂的加样。一旦加样完成，机器人机械臂即刻返回停放位置。随后将该板从机器人平台上取出，并放置于平坦的固体表面上。

将盖玻片轻轻放置在底板上方，使其与间隔层的上部粘性表面接触。必须确保所有96个孔均被完全覆盖，盖玻片与底板对齐成直角，且盖玻片任何部分均不超过底板的轮廓范围。使用滚轮或压辊在盖玻片与间隔层之间形成紧密且均匀的密封。

在此阶段应检查培养板，以确保操作步骤正确无误。预期观察到的现象应类似于平底锅上煎蛋的外观。每个孔中的蛋黄部分对应于中间相（meza 相）。

蛋清是沉淀溶液，锅的边缘是结晶的边界。理想情况下，这三个区域是同心的。现在，该培养皿已准备好放入温度可控的储存区域，以进行晶体生长。

若不再需要设置更多培养板，则应将沉淀剂块从机器人甲板上取下，妥善密封后放回储存。将含有mease的注射器从机器人的分配臂上取下，拆解其各个部件，包括分配针和ferial，用甲醇仔细清洗并干燥，以备下次在Meso机器人中与Mosquito LCP联合使用。

下一个视频片段展示了可用于设置原位结晶实验的蚊式 LCP 机器人。该机器人采用了与本文前面所述相似的 Meph 相分配系统。然而，对于机器人一，沉淀剂是使用一次性吸头进行分配的。

此处显示的是仪器本身。它包含一个平台，用于放置结晶板和沉淀剂块，以及一个带窗口的腔室，用于控制湿度。在此视图中，湿度腔室的窗口已被打开，同时还包括一个装有分配吸头的卷轴、一个微量分配臂，以及一个基于激光的传感器，用于确定液相分配针的位置。

一个升高的平台用于放置结晶板，旁边是一个凹陷的平台，用于固定沉淀剂筛选块。在此流程中，机器人在仪器启动时会执行一系列初始化操作。通过编程软件设置仪器，以适配特定的结晶板和沉淀剂块，并按照指定顺序分配定量的酶液和沉淀剂。

这些细节由制造商提供，此处不再展示。使用机器人设置结晶板的操作步骤如下：按照上述“原位介导机器人一”及 JoVE 1 7 1 2 中所述方法，准备一支配有针头并已装入含蛋白质的介相溶液的汉密尔顿注射器。将该注射器固定于机器人分配臂下方的指定位置。

使用甲板上安装的激光传感器确定分配注射器针头的 X 和 Y 坐标。这是确保将蛋白酶准确地分配到结晶板每个孔中心的重要步骤。通过触摸控制面板上的按钮，即可启动注射器，使蛋白酶从针头尖端排出。

随后用纸巾除去挤出的油相，为机器人加样做好准备，然后将结晶板安装到机器人甲板上。平台表面滴加数滴水以保持湿润，有助于固定结晶板。通过毛细作用移除板上的保护盖，将结晶板牢固地放置于平台上，确保良好贴合。

在平台上有三个定位标记，三个角落的孔位以此为中心，以确保微孔板相对于分配针尖的正确位置。此时，仪器已准备好进入设置循环。该过程首先进行第二次引液步骤，即在移至加载新鲜基质蛋白（mease）之前，先将 Mease 分配到一块小玻璃板上。在此流程中，我们看到机器人首先为微孔板上的八个垂直排列的孔加载 mease，然后使用一次性吸头将沉淀剂溶液分配到 mease 团块的上方。

此过程在整块板的长度方向上重复进行11次，直至所有孔均被填满。整个过程约需五分钟完成。在本视频中，每个孔中分别加入50纳升的Mease和800纳升的沉淀剂溶液。

将填满的微孔板从放置在实验台上的机器人平台中取出。按照上述Meso机器人一中的描述，盖上盖玻片，并用乳贴密封微孔板。正确标记后的微孔板现在可置于温控环境中，用于Meso机器人三（Griffin LCP）中的晶体生长。

这段最终的视频片段展示了Griffin LCP机器人在进行原位结晶实验设置时的使用情况。Griffin所采用的甲基戊醇相分配系统与上述机器人一中描述的系统类似。但在本例中，96种沉淀剂溶液可同时分配。

此处显示的是仪器本身。它包括一个放置结晶板和沉淀剂板的平台、一个测量分配臂和一个 Phoenix 96 吸头装置。在最后一个视频片段中展示了机器人正在运行时分配沉淀剂溶液的过程。

首先用沉淀剂溶液加载96通道头。系统提供用户自定义延迟，以方便吸取黏稠的沉淀剂。MEA相按顺序依次分配至96个孔中，整个过程约需一分钟完成。

最后，96头移液装置将96种沉淀剂溶液同时分配至结晶孔中MEA相液滴的上方。整个板加载过程在两分钟内完成。将填满的板从机器人工作台上取下，用盖玻片密封，并置于受控温度条件下储存，以进行晶体生长。

大分子晶体学进行结构测定的整体流程中的后续步骤包括收集晶体并进行低温冷冻，以及记录和处理来自晶体的X射线衍射数据。这些主题在本系列的其他专题文章中分别进行介绍。