开发源自人诱导多能干细胞的无血清拟胚体，用于通过生理相关性检测方法研究三维干细胞培养

本方案针对3D人源iPSC无血清胚状体的总体目标是提供一种体外系统，以模拟人类早期皮层发育过程，可用于药物发现。该方法有助于回答干细胞领域的一些关键问题，例如神经元如何从iPSC分化而来，并在3D组织中形成功能性神经网络。该技术的主要优势在于，它使我们能够在培养皿中模拟皮层发育的某些方面，所用组织来源于携带疾病个体遗传背景的人源细胞，因此该系统可作为基于细胞的药物筛选平台，具有可扩展性，并可用于研究多种不同的神经生物学疾病。

尽管该方法可为神经生物学或神经发育障碍提供研究线索，但也适用于其他系统，例如专注于神经免疫功能或神经信息模型的研究。本实验方案首先需建立胎儿细胞。为建立该培养体系，将600,000个胎儿细胞接种至6孔板的每一孔中，每孔加入300毫升培养基。

将胎儿细胞培养 48 小时后，更换培养基。在准备干细胞的同时，将培养板孵育 1 小时。在 37 摄氏度水浴中解冻干细胞。

解冻后，将细胞转移至15毫升锥形管中，并逐滴加入培养基至总体积达到5毫升。随后，将细胞在4分钟内轻柔离心，吸除上清液，并用含ROCK抑制剂的1毫升干细胞培养基轻柔重悬细胞沉淀。在测定细胞密度后，将300,000个干细胞接种至饲养细胞层上。

随后培养并扩增细胞系，定期挑选状态良好的细胞，并在扩增后冻存细胞以备备份。将干细胞克隆在标准培养板上培养，直至其融合度达到50%至70%。然后，采用温和的酶处理方法，并用1毫升移液器枪头轻柔吹打，收集hiPSCs用于神经前体细胞的分化。

轻轻离心悬浮液，吸除上清液，并将沉淀重悬于5 mL人iPSC培养基中。然后，将细胞悬浮液转移至经0.1%明胶包被的5 cm细胞培养皿中，孵育1小时。1小时后，将未贴壁的细胞转移至15 mL离心管中。

然后用 3 毫升培养基轻轻冲洗培养板，并将其转移至同一离心管中。接着，再次进行轻柔离心重悬细胞的操作，随后测定细胞密度，并将细胞以每孔 9,000 个细胞的密度接种至 96 孔低吸附 V 型底培养板中。现在，将培养板离心 3 分钟，然后开始培养细胞。

在接下来的14天内，每隔一天用新鲜的分化培养基一更换一半的培养液。培养细胞两周后，准备六孔板，每孔中放入40微米的细胞培养小室，并加入1毫升DM1培养基。在接种培养细胞前，将六孔板孵育至少4小时。

接下来，使用200微升宽口移液枪头，收集约含20微升培养基的两周龄细胞聚集体。将4至6个聚集体转移至每个插入物上，尽量减少溶液量，并去除任何多余液体。在此步骤中，重要的是操作要迅速且手部保持稳定；在去除SFEB周围培养基时，由于表面张力的作用，可能会观察到SFEB在溶液中移动。

在去除培养基后，可以重新调整它们的位置。待所有细胞团块都接种到插入式培养小室后，更换为1毫升DM2培养基，并每隔一天继续培养细胞。每次更换四分之三的新鲜培养基。

培养14天后，开始向培养物中添加DM3培养基。继续培养16天，以生长SFEBs。现在使用200微升宽口吸头轻轻将SFEBs从插入物上分离。

将SFEBs转移至12孔板中，每孔接种4到8个。然后按照文本方案中所述进行染色。在准备12孔板和8孔板时，应先用无菌水洗涤三次。

然后，先用75%乙醇洗涤一次，再用100%乙醇洗涤一次。接着，将培养板倒置，在50摄氏度下烘烤四到五小时，以完成灭菌过程。烘烤后，向每孔中加入500 µL的0.2% PEI溶液，并在室温下静置一小时。

然后，吸除PEI溶液，用无菌蒸馏水洗涤各孔四次，并在空气中过夜晾干。次日，用L15培养基配制新鲜的层粘连蛋白溶液，每孔中心加入10 µL。随后，在周围储液池中加入蒸馏水以防止蒸发，将培养板于37°C孵育1小时。

务必确保将神经组织片置于电极中央，小心避免超出接地电极的范围；若超出该范围，神经元将生长至接地电极上，导致噪声伪迹并影响记录的保真度。随后，使用宽口移液管通过轻柔抽吸的方式将一个预先制备好的SFEB加入每个孔中。然后，向每孔加入200 µL的DM2培养基，并将培养板过夜培养。

随后，为了记录神经活动，将培养板放入酶标仪中，预热至 37 °C，然后使用软件记录每个孔 10 分钟的活动数据。

SFEB采用所述方法培养，所得组织具有类似早期发育皮质下室带的形态学特征，富含大量Tuj1阳性神经元以及神经前体细胞。在类器官的外层和内层均观察到众多正在发育的皮质玫瑰花结结构。类器官的外缘类似于正在发育的皮质板，含有终末分裂后的神经元，这一特征由Brn2的表达所支持；Brn2是神经前体细胞以及最腹侧外层皮质的标志物。

外层还含有 Reelin 阳性细胞，这些细胞可能是偶然的 gratzel 细胞或其前体细胞。这些细胞还表达与尾侧和内侧神经节隆起混合起源相一致的标志物，该结论基于 cooked TF2 和 Nkx2.1 标志物的表达情况。

培养的SFEBs可生成CalR和CalB阳性的中间神经元，以及VGLUT阳性的兴奋性神经元和Tbr1阳性的谷氨酸能神经前体细胞。与其他报道一致，来自类脑体的细胞中，61%为VGLUT阳性，43%为Tbr1阳性。

从身体获取的MEM记录可长时间采集，这些记录显示了皮层网络水平簇状放电的发展。观看本视频后，您应能充分理解如何从人iPSCs培养SFEBs，利用NSFEBs表征惩罚性发育中皮层玫瑰花结的神经管样结构内容，并对成熟的SFEBs进行神经生理学检测。

通常，刚接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为需要一定的时间和实践才能掌握诱导多能干细胞（iPSCs）的培养特性以及iPSC向神经元分化的相关技术。培养的细胞应每天进行观察。在完成该操作步骤后，可进一步采用其他方法（如钙成像）来回答更多科学问题，例如药物处理对皮层神经网络振荡可能产生的影响。