基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

本文所述实验方案的总体目标是解析初级纤毛在新皮质发育过程中的作用。研究表明，初级纤毛在新皮质发育的多个阶段中至关重要，包括前体细胞的扩增、命运决定以及神经元的迁移和成熟。为了进一步解析细胞在新皮质发育中的参与机制，我们利用新兴的基于诱导多能干细胞（iPS细胞）的二维和三维新皮质发育模型，建立了相应的研究工具。

换句话说，即神经玫瑰花环结构和背侧前脑类器官。基于三维iPS细胞的模型始于胚状体的形成。将所述胚状体进行贴壁培养，可生成二维神经玫瑰花环结构，而将这些胚状体进行悬浮培养，则可生成背侧前脑类器官。

我们建立的用于生成脑类器官的方案基于先前已发表的采用拟胚体方法的方案，通过添加预模式化因子，并利用激活素Nodal和BMP通路抑制剂（即双SMAD抑制）来特异性地生成前脑背侧类器官。为了充分利用类器官的三维结构，我们建立了一种简单且快速的方法，可对整个类器官进行完全免疫标记、透明化处理和高分辨率成像采集。为了专注于初级纤毛的生物发生及其功能研究，我们对游离漂浮的振动切片机切片进行了免疫组织化学染色的优化。

免疫染色并清除切片后，我们采用共振扫描共聚焦显微镜获取图像。从含有较大且规则集落的iPS细胞培养物开始，其分化程度应低于10%，且汇合度不超过80%。使用针头手动分离每个iPS细胞集落，精确地在水平和垂直方向上切割，形成棋盘状模式，将每个集落均等地分割为若干小簇。

使用细胞刮刀将细胞集落刮下，并转移至超低吸附培养板中。在培养箱中静置过夜，使其形成类胚体。次日更换培养基，注意避免吸走类胚体，并将类胚体转移至多聚-L-鸟氨酸-层粘连蛋白包被的培养皿中，直至形成神经玫瑰花环结构。

大约需要12至14天。每天更换诱导培养基，并在显微镜下观察神经玫瑰花环结构的形成。从这一步开始，神经玫瑰花环可进行扩增、分化，并用于免疫染色分析，或经解离后获得分离的神经干细胞和前体细胞培养物。

首先，从含有较大且规则的克隆、分化程度低于10%的iPS细胞培养物开始，这些细胞应在单层培养中传代约一次。在第0天，将iPS细胞置于EB培养基中形成拟胚体，该培养基含有低浓度的fJ2和高浓度的ROCK抑制剂，以确保hiPSC细胞存活，避免干扰拟胚体的形成；将培养板置于培养箱中培养三天，期间不更换培养基。到第3天时，拟胚体直径应约为400微米，并呈现规则的边界。

若以往的标准对大多数胚状体（EBs）而言较为丰富，则需更换为含有双SMAD抑制剂的诱导培养基，以显著促进背侧脑类器官（contra DBs）的发育，最佳时间为6至7天，表明神经管发育的启动。同时，该步骤可将其他脑类器官转化为生长因子减少的基底膜培养体系。从本步骤开始，始终使用无菌剪刀打开肽段，以避免损伤类器官。

首先将约15个类器官转移至一支临床管中。待胚胎体（EB）沉降后，除去培养基，并加入50微升诱导培养基二，然后将类器官转移至含有100微升基质胶和经移液吹打混匀的微型敏感管中。将混合物接种至低吸附培养板孔的中央区域。

最后，将EBs分开培养，确保彼此不接触，以防止其发生融合。将培养板放入培养箱中孵育45分钟，使基质凝固，然后向每孔加入诱导培养基二，并继续在培养箱中孵育。每隔一天更换一次诱导培养基二。

第17天，使用5 ml移液管上下吹打10次，手动解离基底膜基质。将类器官培养板置于转化培养基中，在摇床上振荡培养，以促进营养吸收。重要的是，应使用不同的培养箱分别进行静置培养和轨道摇床培养，以避免振动对贴壁生长的iPS细胞产生不利影响。

固定、通透、封闭以及一抗和二抗孵育等步骤，包括洗涤过程在内，共需10天。我们采用的透明化方法依赖于TDE（一种乙二醇衍生物）。为达到最佳透明效果，需将类器官置于浓度梯度递增的TDE溶液中，每种浓度处理24小时。

进行类器官包埋时，使用由1 ml注射器改装而成的定制主模具系统，用手术刀切除注射器尖端。建议使用低熔点琼脂糖，因其熔点仅为约60摄氏度。在60% TDE溶液中配制4%低熔点琼脂糖，并将其置于水浴中预热至接近37摄氏度，用于类器官包埋前的准备。

用活塞将600微升凝胶溶液吸入注射器中，然后放置样品，并向注射器中再加入400微升凝胶溶液。让凝胶发生聚合，最终样品将理想地包埋在凝胶中，可轻松推入照明腔室，使类器官位于物镜前方。对于此类透明类器官的初次成像，荧光照明显微镜是理想选择。

我们降低了光成像的干扰，并实现了亚细胞分辨率。在此，我们使用了浸没在样品腔内80% TDE溶液中的20倍物镜，以精确匹配我们透明化方法的折射率。样品架的设计可容纳一个一毫升的注射器，该注射器可从顶部插入；当样品架安装到位后，可通过推动推杆操作，将类器官精确置于物镜前方。

获取整个类器官大约需要5到10分钟。对于游离切片的免疫染色，将类器官收集并在4℃下于4%多聚甲醛中固定过夜。将类器官包埋于4%低熔点琼脂糖中，使用振动切片机切出150微米厚的切片，共六片，并用毛笔将其转移至PBS溶液中，以避免损伤。

透化和封闭后，在4摄氏度并持续振荡的条件下，将游离切片与一抗孵育过夜。在与二抗孵育前需小心洗涤切片，并在室温及振荡条件下孵育两小时。最后，为获得最佳透明效果，将切片在TDE溶液中以逐步增加的浓度进行孵育：先在60% TDE中孵育1小时30分钟，随后在80% TDE中于室温孵育过夜。

将切片置于 80%TDE 和 TLAC 溶液中，于 4°C 下保存。将游离漂浮的切片置于细胞培养腔室中，尽量保持样品处于 80%TDE 溶液中，并确保腔室可适配临床显微镜的电动载物台。首先，将一片圆形盖玻片放入腔室内，然后使用画笔小心转移透明保护层。

向腔室中加入80% TDE溶液，然后放入两片标准盖玻片、一片第二轮用盖玻片以及一片硅胶密封垫。最后拧紧腔室的螺纹环，以完全密封系统。夜间成像及共振采集数据通过软件进行处理，该软件支持三维图像的使用及对整个免疫染色样品的分析。

此类软件可快速打开我们生成的大量数据，便于轻松截取图像和制作动画。通过二维切片工具，可以在不同方向（例如 X、Y 和 Y、Z）对样品进行多角度观察，并生成相应的二维视图。此外，该软件还能自动检测中心体和初级纤毛，从而量化病理条件下与对照条件下的数量差异。

它还允许对初级纤毛进行三维重建，以精确定位测量位点。我们所描述的基于二维iPS细胞的新皮层发育模型构建方案，可生成包含新皮层前体细胞和神经元的神经玫瑰花结构，这些细胞与发育中新生皮层中的细胞相似。可通过传统的免疫染色分析进行详细的验证。

适用的前体细胞应使用双重染色以影响敏感性，而中间前体细胞通过TBI2染色显示，早期骨皮质神经元则通过CTIP2阳性染色显示。此类类似神经玫瑰花环的结构可模拟放射状前体细胞的核间期迁移，可通过使用抗磷酸化波形蛋白抗体进行免疫染色来观察，该抗体可标记有丝分裂核，以及TBX2抗体，后者可维持有丝分裂纺锤体。最后，可通过使用针对中心粒周围物质的抗体进行免疫染色来分析纤毛发生，该抗体可标记初级纤毛的基体，以及某些可标记轴丝的试剂。

在这种玫瑰花环样结构中，初级纤毛主要来自顶端的多能性Fabri-Kal前体细胞，并密集分布于每个室管膜样区域中央管腔的上方，同时也在CTIP2阳性神经元上突出生长。离散腺神经玫瑰花环结构可建立分离的神经干细胞和前体细胞培养体系，该体系对于研究初级纤毛的生成及其功能具有重要价值。特别是，本文详细阐述了在使用推荐的音猬因子（sonic drug）或osmosin激动剂处理后，检测音猬信号通路激活的实验操作流程。

后续的RT-PCR分析检测了sonica药物靶基因（如GLI1和PTCH1）的诱导表达，免疫荧光分析则检测了关键sonica药物组分在初生纤毛上的动态变化，这些动态可通过开源工具ilastik和CiliaQ进行量化。本研究不仅考察了纤毛的不同参数（包括长度和方向），还展示了在推荐的sonica药物处理下，GLI2和GPR161在初生纤毛中的强度变化，其中GLI2会在药物作用后在纤毛中累积，而GPR161则从纤毛中移出。我们详述的基于3D诱导多能干细胞（iPS细胞）的新皮质发育建模方案，可生成具有背侧前脑特征的均质脑类器官，这些类器官可通过传统的免疫染色分析或本研究中展示的全标本染色（whole-mount staining）进行表征。抗体能够充分渗透至类器官内部，所使用的抗体分别为N-钙黏蛋白（N-cadherin）、PAX6和CTIP2，它们分别标记神经元钙黏蛋白（呈粉红色）、位于类似脑室区区域的顶端前体细胞（呈绿色）以及位于类似皮质板区域的所有新生新皮质神经元。

这是第二个使用抗体对整个免疫染色类器官进行成像的视频，其中CTIP2抗体呈红色（可能保持为粉红色），TPX2抗体呈绿色，可用于检测新皮质前体细胞的多种特征，例如放射状胶质前体细胞的核间期迁移。有趣的是，在类似脑室上区的区域中也观察到磷酸化波形蛋白阳性的前体细胞，其具有独特的阳性突起延伸至表面，类似于外层放射状胶质前体细胞，展示了该方法的高分辨率。以下是一个免疫染色游离切片的视频，通过共振扫描显微镜获取，显示了用中心体周围蛋白抗体标记的初级纤毛（绿色，标记纤毛基部）以及用ARLT3B抗体标记的轴丝结构（粉红色）。

初级纤毛从所有神经干细胞和前体细胞延伸而出，尤其在顶端前体细胞的顶端表面，以及类似前板区域的新皮层神经元中也存在。最终，二维神经元玫瑰花环结构以及分离的干细胞和前体细胞重现了大脑皮层发育的多个方面，是研究纤毛生成与功能的互补性且有用的工具。我们在此检测的方案使我们能够成功地从这些独特的人诱导多能干细胞系生成背侧前脑类器官，获得高度均一的结果，确保了该实验流程的可靠性。

我们建立的针对整个类器官或游离切片的免疫染色、透明化和成像方案简单、快速且成本低廉。将此类基于细胞的模型与3D成像分析相结合，应用于通过重编程纤毛功能障碍细胞或利用CRISPR 9技术特异性编辑纤毛基因所生成的iPS细胞，有望显著推动对初级纤毛在大脑皮层正常及病理发育过程中作用的理解。