从烟粉虱 Bemisia tabaci 中提取内共生菌的方法

本实验的总体目标是从微小昆虫中提取内共生菌，用于后续实验。该方法有助于回答昆虫学和宏观生物学领域的一些关键问题，因为大多数内共生菌无法在体外培养。因此，建立能够分离出足量细菌以用于后续实验的方法至关重要。

该技术的主要优势在于能够方便地分离烟粉虱的细菌内共生体。该方法也可应用于其他昆虫（如蚜虫、叶蝉和蓟马）内共生体的分离。首先，收集一只成年烟粉虱个体，并将其在30 µL裂解缓冲液中进行匀浆处理。

将匀浆在 65 摄氏度孵育 1 小时，然后在 100 摄氏度处理 10 分钟。使用烟粉虱 DNA 和线粒体细胞色素氧化酶 1 引物，按以下试剂配制 25 微升 PCR 反应体系。

然后，使用此处所示的程序进行PCR反应。接着，按照推荐的方案使用DNA凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。随后，根据文本方案进行序列分析。

为了扩增烟粉虱体内每种内共生菌的特定基因，对烟粉虱DNA进行PCR扩增。根据先前发表的实验方案，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及测序，以确定烟粉虱体内的细菌种类，并鉴定每种细菌的特定基因。为解剖并纯化烟粉虱的菌体器官，向载玻片上加入100 µL的1×PBS溶液。

然后，从棉叶上选取三龄或四龄若虫，并将其浸入PBS中。在显微镜下，使用精细的昆虫学针将虫体内的共生菌器官从烟粉虱体内取出。

分离共生体时需小心操作，因为其体积小且脆弱。轻轻在若虫的一侧剪开一个小孔，然后轻压另一侧，使共生体排出。接着，将20微升的微量移液吸头安装到0.5至10微升的移液器上，从PBS溶液中吸取单个共生体至微量移液吸头中。

用移液器将菌体组织移入 PBS 中并进行提取，以去除其他烟粉虱组织的污染。重复洗涤三次。强烈建议重复洗涤，以尽可能去除更多污染。

立即将洗涤后的菌群用移液器转移至含有 60 µL PBS 的离心管中。使用注射器将制备好的菌群通过 5 µm 滤膜进行过滤。重复过滤多次，以彻底使混合液体通过滤膜。

为了扩增滤液，配制缓冲液 D2，用于血液或细胞基因组 DNA 扩增的推荐方案，并进行部分修改。直接将 1.5 µL 滤液加入离心管中，随后加入 1.5 µL 缓冲液 D2。充分混匀后，将样品置于冰上孵育 10 分钟。然后加入 1.5 µL 终止溶液。

加入15 µL反应缓冲液和1 µL DNA聚合酶，轻轻混匀。将混合物在30 °C孵育16小时，随后在65 °C孵育3分钟。使用针对细菌设计的特异性引物，直接对扩增后的滤液进行PCR，以确认细菌种类。

同时，根据已发表的方法，使用针对烟粉虱基因 beta-actin 和 EF1 的引物进行 PCR，以确认是否存在来自宿主基因组的污染。最后，按照文本方案进行宏基因组测序。在本图中，展示了用于饲养烟粉虱的棉花以及烟粉虱的多个发育阶段。

包括成虫以及一龄、二龄和四龄若虫。此处展示了MEAM1四龄若虫体内共生菌Portiera和Hamiltonella的FISH分析结果。观察到两种细菌存在重叠分布，且均局限于粉虱的含菌细胞内。

图中显示了粉虱体内共生菌 Portiera 的透射电子显微镜图像，表明 Portiera 可能正在失去其细胞壁。在完成测序并去除接头序列和重复数据的污染后，获得了专性共生菌 Portiera 的完整基因组，其基因组为环状结构，共包含 358,232 个碱基对。

此外，获得了汉密尔顿氏菌（Hamiltonella）的一个草图基因组，该基因组包含138个重叠群，根据成对末端关系组装为89个支架。一旦掌握该技术，若操作得当，可在20小时内完成。在进行该实验过程中，重要的是要注意防止环境细菌对样品造成污染。

通过该实验步骤，还可进一步开展其他分析，例如RA测序和大规模细菌组分析，以回答有关内共生菌基因表达和代谢等方面的问题。该技术建立后，为昆虫学和微生物学领域的研究人员探索昆虫或节肢动物体内内共生菌的功能开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从昆虫的菌体中提取共生菌。

请注意，某些试剂的操作可能存在危险，因此在进行本实验时，务必采取佩戴手套等防护措施。