通过免疫荧光和定量PCR对烟粉虱组织中双生病毒的定位与定量

明确病毒在烟粉虱媒介体内的空间分布和数量，有助于理解双生病毒与烟粉虱之间的相互作用，并为防控严重的双生病毒病害提供新策略。该技术的优势在于，我们能够快速分离烟粉虱组织，实现病毒蛋白与烟粉虱蛋白的共定位，并对烟粉虱整体以及感染病毒的植物中的病毒进行定量分析。在病毒获取后的适当实验时间点，将经冰麻醉的雌性烟粉虱置于载玻片上的PBS液滴中，在体视显微镜下使用精细的针灸针切开烟粉虱的腹部。

用针取出中肠，并将中肠放入盛有PBS的收集皿中。为收集成对的唾液腺（PSGs），从靠近头部的背部将虫体在胸部处分开，并用针穿过胸部固定烟粉虱。用第二根针轻轻抖动烟粉虱，直至两个唾液腺与虫体分离，然后将腺体转移至另一盛有PBS的培养皿中。

采集卵巢时，完全打开腹部，用针将卵巢与其他组织分离。用移液器去除多余组织，将卵巢转移至新的含有PBS的培养皿中。采集血淋巴样品时，取10微升PBS滴加到新的显微镜载玻片上，将一只新的烟粉虱放入液滴中。

使用细针灸针在腹部轻轻刺一个小孔，然后对腹部施加轻微压力，使血淋巴释放到缓冲液中，并收集8微升液体样本。为了观察收获的烟粉虱唾液腺、中肠或卵巢组织中TYLCV的定位情况，将15至20个样本转移至一个直径3.5厘米的玻璃培养皿中，并吸除多余的缓冲液。

在室温下用 1 毫升 4% 多聚甲醛固定组织 2 小时，然后用 1 毫升新鲜 TBS 洗涤样品 3 次，每次 2 分钟。最后一次洗涤后，加入 1 毫升 0.5% Triton X-100 透化 30 分钟，随后用 1 毫升 TBST 洗涤 3 次，洗涤方式同前。最后一次洗涤后，在室温下用 1 毫升 1% 牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点 2 小时，然后按前述方法用 TBST 洗涤 3 次。

最后一次洗涤后，在避光条件下，于4°C用目标一抗对细胞进行过夜孵育。次日早晨，用TBST洗涤样本三次，然后在避光条件下，室温下加入相应的二抗孵育两小时。孵育结束后，将中肠洗涤三次，并将样本转移至洁净的显微镜载玻片上。

尽可能吸除缓冲液，然后滴加一滴 DAPI 对细胞核进行染色，盖上盖玻片后通过共聚焦显微镜观察标记的组织。对于番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的定量分析，将采集的烟粉虱组织样本用新鲜 PBS 洗涤两到三次，然后将 20 个中肠、20 个唾液腺（PSG）或一个卵巢连同 5 µL PBS 转移至含有 25 µL 裂解液的各个 PCR 管中。向每根 PCR 管中加入 5 至 7 颗直径为 2 毫米的陶瓷研磨珠，随后在均质仪中研磨样本。

取八微升血淋巴样品加入新的PCR管中，再加入10微升裂解液，充分混匀。将所有样品在65摄氏度孵育1小时，随后在100摄氏度孵育10分钟，并进行短暂离心。接着，向定量PCR八联管的各管中加入18微升预混液，并向至少三个管中分别加入两微升的每种DNA样品。

当所有样品加样完毕后，盖上管盖，离心使溶液沉降至各离心管底部。将离心管放入实时荧光定量PCR仪中进行定量PCR扩增，选择cyber作为荧光染料，样品类型设为未知（unknown）。随后将定量数据导出至电子表格，用于分析各样品中病毒DNA的相对含量。

此处展示了TYLCV在烟粉虱唾液腺、中肠和卵巢中的DAPI染色代表性图像。如图所示，TYLCV在唾液腺和中肠中的积累量高于卵巢。烟粉虱在感染TYLCV的番茄上取食24、48和72小时后，对其唾液腺、中肠、血淋巴和卵巢中病毒量的定量分析表明，随着获毒时间的延长，病毒在烟粉虱不同组织中的含量呈正相关增加。

最好使用新鲜的粉虱，因为死亡的昆虫会增加解剖难度。按照本实验步骤，还可进行其他分析，如蛋白质印迹和免疫共沉淀，以进一步研究病毒蛋白的表达以及病毒蛋白与媒介蛋白之间的相互作用。