利用光片荧光显微镜观察小鼠胚胎运动轴突导向及量化轴突分支

本方案的主要目标是利用光片显微镜和图像分析软件对小鼠胚胎中的运动神经元轴突分支模式进行定性和定量评估。该方法有助于理解运动神经元发育与复杂运动协调之间的关系。该技术的主要优势在于，可以从多个角度观察和成像运动神经元的轴突分支模式，并对每一条神经进行定量分析。

本实验操作将由我实验室的两名研究生颜雅萍（Ya-Ping Yen）和廖怡珊（Ee Shan Liau）进行演示。开始实验时，将胚胎分别固定于24孔板中，每孔加入1毫升 freshly prepared 的4%多聚甲醛（paraformaldehyde）PBS溶液，4°C摇床过夜固定。次日，用1X PBS溶液至少洗涤胚胎三次，每次5至10分钟，每次使用1毫升PBS，随后于4°C孵育过夜。

接下来，在摇床上，用1毫升0.5% PBST于4摄氏度对每个胚胎透化过夜。在摇床上，用1毫升含10% FBS的1×PBS于4摄氏度封闭每个样品过夜。随后，在4摄氏度下，将每个胚胎与1毫升抗GFP一抗抗体在持续振荡条件下孵育72小时。

一抗孵育后，在摇床上于4°C条件下，用1毫升0.5% PBST洗涤每个胚胎，持续一至两天。随后，加入1毫升二抗，于4°C避光条件下持续振荡孵育过夜。次日，在摇床上于4°C条件下，用1毫升0.5% PBST对每个胚胎至少洗涤三次，每次洗涤持续两至三天。

然后，将每个胚胎置于折射率为1.49 nd的商用透明试剂中，在1.5毫升离心管中避光、室温下孵育过夜。设置5X/0.1照明光学系统和5X/0.16检测光学系统。组装样品 holder 和样品毛细管。

通过加入透明溶液来准备样品室。为了固定胚胎，准备一个P200移液器吸头，剪去上部，使其直径与毛细管匹配，并去除尖端部分以便附着样品。然后，用小火焰熔化移液器吸头的钝端。

熄灭火焰，迅速将胚胎垂直附着在熔化的末端。用样品毛细管套上移液管吸头的上部，并将制备好的样品室放入显微镜中。使用成像软件，在“定位”选项卡下选择“定位毛细管”，并调节 X、Y 和 Z 轴。

接下来，选择“定位样本”，并将放大倍数调整至0.6倍以聚焦胚胎。让腔室缓冲液与胚胎充分平衡一段时间，以清除任何碎片或气泡。在“采集”选项卡下进行图像采集时，需设定光路参数，包括探测物镜、激光阻挡滤光片、分光镜、相机和激光器。

选中“Pivot Scan”复选框以减少阴影。然后，设置采集参数：位深度为16位，变焦范围为0.36至0.7倍，选择单侧照明或双侧照明。点击“Continuous”并设置激光强度、曝光时间、激光功率和光片位置。

随后，按“停止”以结束图像采集。必须确保透明样本位于最短光路中，以便对单个运动神经上的精细分支结构进行详细成像。对于多维采集，通过移动首幅和末幅图像的 z 位置来定义 Z 轴层扫范围。

单击“最佳”以设置切片数量，然后单击“开始实验”以获取选定的Z轴图像序列。完成后，将图像保存为czi格式。

为了量化轴突分支，使用图像分析软件打开图像文件。在“显示调整”窗口中调节图像的颜色、亮度和对比度，以便基于局部强度对比度检测纤维结构。接着，点击“添加新纤维”图标，并在下拉菜单中选择“自动路径算法”。

选择感兴趣区域，然后通过在切片模式下测量可获得的最大和最小直径值来定义起始点和种子点。在感兴趣区域的边缘设置起始点。如需手动添加或删除起始点，首先更改指针模式为选择导航模式，然后在目标位置按住 Shift 键并单击鼠标右键。

接下来，为种子点选择手动阈值，以确保标记出所有可见的分支结构。然后，手动添加或删除种子点。勾选“移除不连通片段”选项，并删除起始点周围的种子点。

随后，调整背景减除的阈值并完成该过程。必须去除背景伪影，并确认检测路径真实反映轴突分支，以实现准确的定量分析。最后，选择所需的样式和颜色。

在“统计”选项卡下，选择“详细”模式，并使用纤维数量和树突末端点来定量运动神经末梢，作为运动轴突分支的指标。然后，将重建的轴突图像导出为 tiff 文件。LSFM 可提供小鼠胚胎中运动轴突分支的详细三维可视化图像。

运动神经元经上述方案处理后，通过转基因表达的GFP进行标记。为了更详细地观察轴突分支并进行定量分析，可调整放大倍数，以清晰显示每一个精细的分支结构。最后，可利用图像分析软件重建前肢神经单个轴突的分支模式。

软件中的自动路径算法可追踪细丝并量化轴突末端的总数。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备样品，并使用光片荧光显微镜对小鼠胚胎的运动神经元轴突进行成像。此外，您还将了解如何通过MRS对每条单个运动神经的分支模式进行定量评估。