一种用于植物/微生物分子互作与信号传导同步系统分析的水培共培养系统

该系统的主要目标是通过一种简单且接近自然环境的实验装置，研究植物与微生物伙伴之间的相互信号传导与响应，或植物对化学物质及非生物因素的响应。本视频展示了植物与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的共培养过程。该方法有助于回答植物-微生物互作、微生物或植物应激反应以及分子信号传导领域中的关键科学问题，包括在植物与微生物互作初期阶段的复杂信号交流过程。

该技术的主要优势在于，它能够在包含自然环境模拟的简单装置中，帮助理解植物与微生物相互作用的信号传导及响应特性。尽管该方法可用于研究植物与单一微生物物种之间的相互作用，也可用于研究植物与多种微生物物种或非生物因素的相互作用。我们在探索植物-微生物相互作用过程中细胞信号稳态时，希望尽可能模拟自然状态，由此提出了该方法的构想。

实验开始前，必须对种子进行灭菌处理。对于拟南芥（Arabidopsis thaliana），取约200粒种子与500微升去离子水加入微量离心管中，高速涡旋混匀。然后将离心管置于台式微量离心机中，以9000 × g离心30秒。

使用移液器去除上清液。接着，向种子中加入 300 µL 2% 次氯酸钠溶液，并涡旋混匀。将混合物在室温下静置。

一分钟后，离心种子。用移液器吸除次氯酸钠溶液。然后向种子中加入500 µL无菌去离子水，并涡旋混匀。

离心管子后，去除上清液。向种子中加入500微升70%乙醇，并涡旋混合。让种子静置1分钟后，再次离心管子。

用移液器除去70%乙醇。用500微升无菌去离子水清洗种子五次。然后，将灭菌后的种子重悬于500微升无菌超纯水中。

将25毫升含0.4%植物琼脂的半倍浓度Murashige和Skoog（MS）培养基倒入每个无菌的深型培养皿中。对每个培养皿，剪取一块90毫米×90毫米的不锈钢网。将每片金属网的四个角略微弯曲，使其刚好能够放入培养皿内。

将网片边缘处弯折成与网片主体呈90度角，使网片可通过边缘支撑架起，下方留出足够的空间供根系生长。将裁剪好的网片方块放入烧杯中，并用铝箔覆盖。使用高压灭菌器，采用30分钟干热循环对网片方块进行灭菌。

当培养基在培养皿中凝固且筛网已灭菌后，将每块筛网小方块放置于固体培养基表面，弯曲的角朝下。轻压筛网，使四个角插入培养基中，同时筛网主体与培养基表面充分接触。随后，使用无菌的 200 微升移液器吸取经表面灭菌的拟南芥种子，将每粒种子轻轻转移至筛网上方。

根据植物种类和实验需求将种子放置于适当间距。用培养皿盖封好培养皿，并在培养皿边缘贴上多孔外科胶带。用铝箔包裹种子。

将整个培养皿置于适宜条件下进行种子分层处理。两天后，在22至24摄氏度、16小时光照周期的条件下培养培养皿中的种子10至14天。在无菌操作台中，将18毫升经高压灭菌的液体MS培养基倒入带有无菌盖子的无菌圆柱形玻璃罐中。

接下来，使用无菌镊子将每个带有10至14天幼苗的网格方块从半固体培养基的培养皿中轻轻转移至水培圆柱形罐中。此处所示幼苗为苜蓿。使用多孔外科胶带将罐盖密封。

然后，在22至24摄氏度条件下，以16小时光照周期、50 rpm振荡培养幼苗。接种前，仔细检查幼苗培养罐是否存在任何潜在污染。未受污染的培养罐中的培养基应保持清澈透明。

若培养罐因污染而浑浊，则将其丢弃，并对剩余的培养罐进行编号。从每个编号的培养罐中取 20 微升水培培养基，滴加到含有LB肉汤或LB琼脂的培养皿上。将培养皿在 28 摄氏度下孵育 28 小时。

立即将每50微升农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）悬浮液接种至每个编号的水培罐中。将幼苗与农杆菌（A. tumefaciens）在22至24摄氏度、16小时光照周期及50 rpm振荡条件下共培养。在培养12小时和28小时后检查LB平板上的菌落，以验证水培生长培养基的无菌状态。

如果存在任何污染，请勿将相应编号的接种了细菌的培养罐用于后续下游实验。接下来，通过提起网格板将根系与细菌悬浮液分离。若需将根系用于后续分析，应切割根系，用双蒸水快速冲洗，并在灭菌的滤纸上干燥。

若使用叶片或其他组织，需剪取相应组织。进行植物转录分析时，应立即将根部或地上部分放入液氮中。进行细菌转录分析时，从共培养罐中转移1.5毫升培养物，并通过离心收集菌体细胞。

经过适当的共培养后，使用无菌剪刀分离单个二级根，即主根的侧枝。接着，用双蒸水冲洗根部，以去除松散附着的物质。将每根根置于载玻片上30微升水中，完全浸没，并加盖盖玻片。

用指甲油密封盖玻片边缘，以防止根部脱水。然后通过荧光显微镜观察根癌农杆菌（A tumefaciens）与拟南芥（A thaliana）根部的附着情况。经过适当的共培养后，将植株从水培培养基中分离出来。

将18毫升水培培养基通过0.2微米孔径滤膜过滤，收集至50毫升锥形管中以实现灭菌。将样品在-80摄氏度下冷冻过夜。次日，松开50毫升锥形管的管盖，将其放入冷冻干燥机中冻干36小时。

最后，将样品储存或进行后续处理，用于高效液相色谱分析及化合物检测。在未人工添加营养物质的情况下，根癌农杆菌c58在共培养体系中能够生长。相比之下，在不含拟南芥的对照培养中，几乎未观察到细菌生长。

通过本显微成像可见，水培共培养系统可用于研究细菌在植物根部结构上的附着情况，其中以PCherry红色荧光标记的细菌定位于植物根部结构，呈现典型的岩石状或丝状形态。可通过qRT-PCR确定植物组织与互作微生物的基因表达谱。共培养八小时后，八种根癌农杆菌细胞显示出毒力相关基因的表达上调。

同时，拟南芥（A thaliana）的根部在共培养条件下表现出差异基因表达。与对照组相比，在共培养72小时后，接种植物分泌组中的35种化合物含量升高，76种化合物含量降低。该技术为研究人员提供了一种简便的实验体系，可用来研究植物与微生物之间的相互作用，探究植物与微生物或微生物群落伙伴之间的相互响应，以及植物对非生物因素的响应，且该体系能够高度模拟自然环境。

观看本视频后，我们希望您能够建立一种在水培条件下进行植物与微生物共培养的系统，以在更接近自然且易于操控的环境中研究植物分子生物学、微生物相互作用及其信号响应。