用于研究植物-微生物互作的实验室生态系统构建（EcoFAB）协议

本实验方案的总体目标是建立标准化的方法，用于构建简化的模式植物生态系统（称为EcoFABs），从而在实验室中开展可控且可重复的实验，以研究植物与微生物的相互作用，并进一步在田间进行验证。该方法可用于在受控环境中研究植物与微生物之间的相互作用，使我们能够深入理解微生物组功能的分子机制，进而将其应用于可持续农业。我们参与设计了首个EcoFAB，该装置采用多种现有的3D打印技术，并对植物生长室进行灭菌处理，从而支持无干扰的高分辨率成像和化学分析。

本文开发的Eco-FAB装置非常适合用于植物与微生物相互作用的分析，因为它整合了根系形态学分析和质谱成像技术。根据文本方案，使用3D打印技术制备一次性一升容器中的Eco-FAB模具后，将40毫升硅氧烷弹性体基础液与不同体积的固化剂混合，具体体积取决于实验需求。将容器置于真空室中至少30分钟，以去除弹性体混合物中的气泡。

然后，将混合物取出，倒入组装好的3D打印塑料模具中。为了形成均匀的PDMS层，必须仔细去除气泡。将混合物转移至模具后，使用压缩空气吹除残留的气泡。

将模具置于85 °C的加热板上保持4小时。让模具冷却5分钟。然后，轻轻地将嵌件从模具中抽出，并使用美工刀缓慢地将PDMS从浇铸框架上分离。

将带有PDMS的模具基底从浇铸框中向上压出。然后，使用刀片或其他工具在边缘处轻轻分离PDMS层与模具基底，并缓慢将其从模具表面剥离。使用15号钝头针，在PDMS层上打直径为1.6毫米的孔，以形成进样通道。

然后，使用剪刀修剪PDMS层的边缘。为了将PDMS层永久键合到显微镜载玻片上，用甲醇冲洗PDMS层的键合面（对应尺寸为7.6厘米×5厘米的显微镜载玻片），然后用压缩空气或超纯氮气枪吹干。将显微镜载玻片和PDMS层放置于等离子清洗仪中，使它们的键合面朝上。

关闭腔室和气体排气阀。然后打开真空泵，抽真空一分钟。打开等离子体发生器电源，将射频（RF）功率调至高挡，持续一分钟。

然后，关闭真空泵和等离子体电源，向腔室通入空气使其恢复至常压。从等离子体腔室中取出显微镜载玻片和PDMS层，并迅速用均匀压力将PDMS层的四边压紧在载玻片上。确保中心椭圆形区域（即根室）不与载玻片接触。

使用超纯水冲洗Eco-FAB装置。将一个Eco-FAB装置放入Eco-FAB容器中，加入70%乙醇直至装置完全浸没。然后盖上容器盖子，轻轻摇晃，使容器内所有表面均接触乙醇，并确保Eco-FAB装置的根生长室充满乙醇，尽量减少或避免产生气泡。

将装置在室温下孵育30分钟后，倒出70%乙醇，并替换为100%乙醇。然后，将装置孵育5分钟。孵育结束后，排干乙醇，并将已灭菌的Eco-FAB置于超净工作台中干燥16小时，直至完全干燥。

如果条件允许，打开超净台内的紫外灯照射一小时，对系统进行灭菌。进行种子灭菌和萌发时，将种子浸泡在70%乙醇中两分钟。然后用移液器吸去乙醇，并用无菌水冲洗种子三次。

接下来，将种子浸泡在10%次氯酸钠溶液中5分钟。然后，去除次氯酸钠溶液，并用无菌水彻底清洗种子三次。清洗后，向种子中加入无菌水，并将试管在4°C条件下孵育7天。

将种子均匀地播撒在含有0.6% Vitagel的0.5倍Murashige和Skoog（MS）培养基上，并用微孔胶带密封培养皿。然后将植物培养至根长约5毫米。

将幼苗转移至Eco-FAB装置时，使用无菌注射器或移液器及无菌水，对Eco-FAB装置的根室冲洗三次，然后用目标生长培养基（如0.5 MS培养基）填充根室。接着，小心地将一株幼苗插入Eco-FAB装置的植株储液室中。从培养皿转移到Eco-FAB装置时，必须小心操作幼苗，以避免根部断裂。

加入3 mL无菌水至容器中，注意避开Eco-FAB装置。这将增加湿度，并减少根室培养基的蒸发。然后，盖上容器盖，并使用微孔胶带密封盖子。

将Eco-FAB放入植物培养箱中，或在适合相应植物生长的控温环境中使用Eco-FAB光照系统。然后，将培养室温度设定为24摄氏度。最后，根据文本方案进行代谢物谱分析和质谱分析。

这些图片显示了在 Eco-FAB 中生长的七日龄拟南芥（Aaabidopsis thaliana）、二穗短柄草（brachypodium distachyon）和柳枝稷（panicum virgatum）。在 Eco-FAB 中，双子叶植物和单子叶植物均能生长至繁殖阶段。这些幼苗代表了在水培培养基中生长 14 天的二穗短柄草（brachypodium distachyon）群体，以及分别在添加了水培培养基的沙子和土壤中生长的植株。

超薄的固体基质层和根系生长室允许光线透过，便于对根系进行显微成像。此处，一株二穗短柄草（Brachypodium distachyon）幼苗被转移至Eco-FAB装置中，并利用Bio-Rad凝胶成像系统内部的相机记录其根系结构。连续三周对总根面积的定量分析显示，早期阶段根系面积逐渐增加，随后呈现线性增长趋势直至实验结束。

在此图中，将含有促进植物生长的根际细菌假单胞菌（Pseudomonas simiae）WCS417的Eco-FAB以每株10的6次方个细胞的剂量添加至植物根系。WCS417微生物定植于整个根系表面，且在根尖区域周围浓度较高。在更换Eco-FAB的培养基并收集根系分泌物时，务必在无菌操作台中完成所有操作，以避免任何污染。

通过使用3D打印夹具或改变PDMS的黏度，也可采用可逆的物理密封方式制备Eco-FAB装置。这种方法能够使用固体生长培养基以及进行直接质谱成像。在Eco-FAB开发完成后，该系统将使全球的研究人员能够利用这些实验室模型生态系统，结合系统生物学和成像技术来研究植物与微生物之间的相互作用。

观看本视频后，您应能充分了解如何构建 Eco-FAB 系统，以及其在生态系统研究中的广泛应用。我们希望这一 Eco-FAB 设计能够帮助其他科研人员实现各自的科学目标。更重要的是，我们期待其他科研人员在此 Eco-FAB 设计基础上进一步改进和完善，并与其他科学家共享，从而作为一个科研共同体，共同构建这些实验室生态系统，以更深入地理解植物与微生物之间的相互作用。

请务必注意，操作微生物和锐器可能具有极高的危险性，在进行此实验步骤时应始终采取必要的安全预防措施。