线虫群体化学感应偏好性实验的自动化分析

本行为记录装置与方案的总体目标是利用多摄像头视频采集系统，对秀丽隐杆线虫（C. elegans）群体对可溶性化合物的化学感应偏好进行量化分析，随后进行自动化视频分析。该方法可通过实现对遗传突变体行为的更快速、更标准化的分析，促进秀丽隐杆线虫神经生物学的研究。该技术的主要优势在于，可在相同条件下同时检测多个重复样本，并实时监测线虫群体对可溶性信号刺激的动态响应过程。

本实验装置的组装将由本实验室的科研人员 Christopher Cronin 进行演示。首先，按照随附文字方案中的说明，准备好织物外罩、相机安装横杆、角撑板、型材杆以及相机安装组件。从连接在中心杆两端的端杆开始，将相机支架和固定套件安装到相机安装组件上。

接下来，组装行为实验箱框架。首先将四根一英尺长的挤压铝条连接到一块方形聚酯片上。将一根铝条滑入织物片上的两个万向T型螺母中，并沿织物宽度方向居中放置铝条。

拧紧紧固件，将织物片固定在每根横杆上。将带有四个附着铝条的方形聚酯片平铺在工作面上，铝条朝上。然后，将八个角码套在四根铝条的上表面，每根铝条的两端各一个。

将角码安装在横杆上，使角码的垂直边与横杆末端对齐，并通过拧紧螺钉固定到T型螺母中。在每个角落竖立一根一英尺长的铝制型材，将型材套入角码两个垂直腿上的T型螺母。然后通过拧紧紧固件将立杆与横杆固定，从而连接两个相邻的水平横杆。

将H形相机支架组件上松动的T型螺母滑入框架立柱内。使H形支架完全下滑，直至其底部与框架每个角落的角撑板顶部接触。通过拧紧四个角撑板上的螺丝，将相机支架组件固定到位。

接下来，使用四根一英尺长的铝制挤出条组装腔体的底层。将角码的支脚与铝条末端对齐，然后拧紧螺丝以固定。随后，将铝条沿着框架立柱之间的通道滑下，使铝条上的T型螺母与立柱上的滑槽对齐。

将横杆放置到位，使其角撑板的上边缘低于立柱开口端一英寸，并通过拧紧角撑板螺丝将其固定。接着，将四块矩形聚酯布上的T型螺母滑入立柱挤出条的槽道中，以覆盖培养室的侧面，并拧紧紧固件以固定。选择一侧作为进入培养室内部的门，并拆下培养室底层的两个螺丝和T型螺母。

在每个角落的顶端放置一个塑料帽，作为完成后的框架的支脚。将框架正面朝上放置，在框架空间层内每张载玻片位置插入两个面板固定器，并旋转以固定到位。然后，在面板固定器上方放置一块12英寸×12英寸的透明亚克力板，作为检测板的承载平台。

最后，按照随附的文字实验方案所述，调整相机和载物台模板的位置。实验前一天，将28个空的35毫米培养皿以每堆不超过五个的方式，放置在平坦表面上。向每个检测培养皿中加入5 mL线虫生长培养基琼脂，并将培养皿去盖后直立放置，在室温下过夜晾干。

实验当天，打开背光源，启动计算机并运行显微镜相机的视频采集软件。将显微镜相机连接至计算机，然后点击软件窗口顶部标有编号的相机缩略图，以查看相机的实时画面。如需调整视频录制设置，请点击相机画面左上角的视频格式下拉菜单，选择 MJPG 1280x1024。

接下来，点击视频格式菜单旁边的文件夹下拉菜单，选择一个用于保存视频文件的文件夹。然后单击相机画面右上角的自动曝光图标，关闭自动曝光功能。接着，单击自动曝光图标右侧的LED图标，关闭显微镜相机内置的LED光源。

单击相邻的设置图标，选择“黑白”模式。最大化对比度，并调整亮度。将溶液放置模板与载物台对齐模板对齐，然后单击相机画面左侧的延时视频录制图标。

输入持续时间为五秒，间隔为一秒，以每秒一帧的速度录制一段五秒的校准视频。使用5毫升玻璃移液管向含有同步化线虫的培养皿中加入1.2毫升线虫生长培养基缓冲液，轻轻振荡培养皿，使线虫悬浮于缓冲液中。从培养皿中吸取含有线虫的缓冲液，转移至一支干净的微量离心管中。

将离心管静置1至2分钟，使线虫沉降到管底。然后用塑料移液枪头尽可能吸除管中的洗涤缓冲液，注意不要扰动管底聚集的线虫沉淀。向管中重新加入1毫升无菌线虫培养基缓冲液，并重复洗涤步骤两次。

接下来，将溶液定位模板用胶带固定在解剖显微镜载物台的上方。然后，在板对齐模板的两侧各贴一条双面胶带。将检测板的边缘与板对齐模板上的圆圈对齐，并向下按压，直至模板粘附在板的底部。

然后，在解剖显微镜下将检测板模板的定位标记与溶液放置模板的定位标记对齐。接着，使用P2移液器在第一和第四象限各加入1微升M13缓冲液。更换新的吸头后，在第二和第三象限各加入1微升10毫摩尔/升的CuCl2溶液。

当溶液液滴完全被琼脂吸收后，使用玻璃巴斯德移液管将洗涤后的线虫转移至检测平板。将线虫液滴置于圆形处理区域上下两侧的位置。将拭子对折四次，用其钝边吸去检测平板上多余的洗涤缓冲液。

立即将检测板按照行为检测室中显微镜摄像头下的模板角标数字对齐放置。等待两到三分钟，使线虫适应检测板环境。然后，点击摄像头画面左侧的延时视频录制图标，设置录制时长为10分钟，时间间隔为1秒，以每秒一帧的速度录制一段10分钟的视频。

最后，单击“开始”以启动视频录制。对于每一帧视频，偏好指数函数会统计每个感兴趣区域中的线虫像素数量，并计算该区域内像素总数中某一像素所占的百分比。此处展示了针对不同基因型和处理组合所获得的偏好指数值。

正值的偏好指数表示对处理条件的吸引，而负值的偏好指数则表示排斥。当在对照区和实验区均放置M13缓冲液时，得到的偏好指数为0.02，表明不存在空间偏好偏差。该图还显示，N2线虫强烈回避铜离子，导致偏好指数达到0.67。

此外，osm-3 突变体在感觉纤毛形成方面存在缺陷，而 ocr-2 突变体在 ASH 介导的伤害感受反应方面存在缺陷，这两类突变体均表现出对铜离子的回避反应减弱，甚至出现轻微的吸引现象。在执行本方案时，重要的是操作要迅速，同时保持平稳和一致。记录装置和实验方案可轻松调整，用于表征由不同秀丽隐杆线虫（C. elegans）感觉类型之间相互作用所引发的群体行为反应。