一种基于 Caenorhabditis elegans 营养状态的铜回避行为检测方法

本实验旨在通过基于营养状态的铜回避检测方法，在四小时内评估线虫对厌恶化学物质和食物来源的反应，从而实现对营养状态的同步评价。该方法有助于行为神经科学领域研究，可鉴定出在饥饿条件下仍无法调节运动模式及对厌恶化学物质产生应答的突变体。

该技术的主要优势在于其可在较长时间内进行，从而能够在蠕虫经历长达四小时的逐渐饥饿过程中，对其营养状态进行分析。为准备实验用生物体，在开始检测前24小时，从每一流中挑选10只L4期线虫，以确保检测时生物体处于年轻成虫阶段。针对每种待测的突变体或对照组线虫，均需挑选10只L4期个体。

使用标准方法，在接种了大肠杆菌OP50的标准琼脂平板上培养L4期生物体24小时。在实验开始前24小时，使用直尺和粗头永久性记号笔，在预先准备好的线虫生长培养基（NGM）平板底部外缘处画一条线，并标记一条距平板两侧边缘等距的中线屏障。

仅在铜屏障的一侧接种50微升OP50大肠杆菌，以形成均匀的菌苔。利用平板底部的标记线确保细菌不会接触到铜溶液。确保铜溶液沿平板边缘分布，形成中线屏障，并在转移细菌时避免铜溶液与食物来源接触。

标记另一组不含 OP50 大肠杆菌的平板，作为阴性对照。让细菌干燥，然后将平板在 37 摄氏度下过夜培养。在将线虫转移至 37 摄氏度培养箱时，确保细菌菌落不被扰动。

过度扰动可能会改变食物斑块的位置或形状。经过过夜培养后，将培养皿从培养箱中取出，以培养皿底部的标记为参考，用移液器在琼脂边缘加入100微升新配制的0.5摩尔硫酸铜(II)溶液，以形成外层铜屏障；再加入25微升硫酸铜(II)溶液，形成中线屏障。

确保硫酸铜溶液不接触细菌菌苔，并让铜溶液在平板上自然干燥。转移后每五分钟检查一次干燥情况，可用实验室纸巾轻轻蘸取平板边缘附近的溶液以判断。在进行实验前，立即将实验用生物转移至无菌细菌的琼脂平板上，让线虫自由移动一分钟，以去除多余的细菌。

接下来，用移液器吸取1毫升M9液体加入含有年轻成虫的培养皿中，这些线虫是24小时前转移至此的，目的是将线虫冲洗至微量离心管中。在3,000 × g条件下离心线虫1分钟。线虫应在管底形成沉淀。

吸取 M9 溶液时不要扰动线虫沉淀。向线虫沉淀中加入 1 毫升 M9 溶液。倒置离心管以混匀线虫与溶液。

如果最初随线虫转移了过量的细菌，则重复此步骤，共进行五次。最后一次洗涤后，吸除上清液，直至剩余约100微升M9溶液及线虫沉淀。完成洗涤后，立即从溶液中转移线虫。

用移液器从管底吸取20微升虫体沉淀，将其转移至检测平板无菌的一半区域，确保转移10条线虫至检测平板，并且无污染性食物存在。不得将任何细菌转移至铜食物竞争平板。在一分钟内用实验室纸巾去除线虫上多余的M9溶液。

确保M9溶液不与硫酸铜溶液接触，并保持线虫和琼脂表面完整。若线虫意外随实验纸巾被移除，则应弃用。当M9溶液完全移除且所有线虫均开始非液体环境下的运动模式时，即停止剧烈摆动后，进行后续操作。

启动实验计时器，如果意外加入了多余的线虫，需用碳氢油挑除，以确保没有细菌被带入培养板。每30分钟检查一次实验培养板。对于含有细菌菌斑的实验培养板，若生物体在四小时内到达食物菌斑区域，则记为阳性结果。

对于阴性对照平板，若生物体已越过屏障，则记为阳性结果。我们使用了 N2 以及 npr-9 功能缺失突变体和一种被称为 npr-9 功能获得的 npr-9 过表达菌株，以评估其对饥饿和铜回避的反应。在实验结束时，100% 的野生型生物体迁移至食物来源处，而 npr-9 过表达的生物体则未根据食物的存在调节其运动模式，即使接触食物后仍持续穿越厌恶屏障。

在无食物的培养皿中，n2或npr9功能缺失的生物体极少跨越铜屏障，而npr-9过表达的线虫则反复多次来回穿越该屏障。进行此操作时，需注意在转移线虫和M9溶液时避免破坏铜屏障，同时应保持每种品系实验条件的一致性，以避免混杂因素的干扰。