一种量化果蝇昼夜节律活动的计算方法

在大多数动物中，昼夜节律钟调控行为和分子过程，并将其同步到每日的明暗循环中。在果蝇中，通常通过运动活动记录来研究生物钟。以下是野生型果蝇在12小时光照、12小时黑暗循环条件下的平均运动活动示例，顶部的黄黑条表示明暗周期。

典型的果蝇活动记录显示出复杂的双峰模式，具有两个活动高峰，一个在黎明前后出现的早晨高峰，另一个在黄昏前后出现的傍晚高峰。这两个高峰共同形成了一种与生物钟基因中观察到的正弦振荡截然不同的波形，表明除生物钟外，其他机制也对行为数据中观察到的模式产生深远影响。本文中，我们提出了首个用于数学描述果蝇活动时间模式的方法。

我们使用一种模拟果蝇运动的模型波形来拟合活动数据。该模型包含四个指数项，其中两项来自早晨峰，另两项来自傍晚峰。结合昼夜节律周期，该模型共有九个独立参数。

B 参数定义了早晨上升、早晨衰减、傍晚上升和傍晚衰减的速率。TM 和 TE 定义了早晨峰和傍晚峰的宽度，HM 和 HE 定义了峰的高度。这些参数共同完整描述了活动模式中早晨峰和傍晚峰的大小与形状。

我们的方法可用于阐明果蝇运动记录中常见双峰活动模式背后的机制及底物。进行运动实验时，准备若干独立的试管，一端装有食物，另一端塞有棉塞。具体操作为：首先，将5至6克果蝇食物放入一个50毫升的烧杯中。

将食物切成小块，以便在微波炉中更容易熔化。单个活动监测仪可容纳32个独立的管子。因此，取32个管子，并用橡皮筋将它们连接在一起。

将烧杯中的食物放入微波炉中熔化。加热食物约10至15秒。每隔五秒停止一次微波炉，并轻轻摇动盛有食物的烧杯，以确保食物均匀熔化。

确保所有食物均已完全融化，烧杯中无任何固体食物残留。在食物仍处于液态时，将试管插入盛有食物的烧杯中。轻轻上下移动试管，使其均匀装液。

让食物冷却并凝固约一小时。食物凝固后，用旋转动作将试管从烧杯中取出，以防止食物粘在烧杯底部。然后取下橡皮筋。

用蜡将管口与食物一并密封。操作时，先用纸巾仔细擦拭管子，然后将管子压入蜡中。

目视检查密封质量，如有必要，重新进行密封。使用此技术，将实验所需的所有试管均密封完毕。试管的另一端用棉花封闭。

棉花允许空气通过，同时将果蝇锁在管内。棉花还易于取出和放回，这在将果蝇装入管中进行实验时非常方便。现在，待试管准备好后，将果蝇装入试管以进行实验。

为此，用 CO2 将果蝇卸至操作垫上。然后，使用毛刷小心地将每只果蝇单独放入各自的试管中。将装有果蝇的试管放入监测仪中。

按照与显示器上相同的顺序，监测系统将把果蝇的运动记录在输出文件中。将显示器连接到计算机，并置于可维持恒定温度和湿度的培养箱中。根据实验要求，设置适当的明/暗条件。

进行明暗实验时，整个实验过程中将果蝇置于明暗循环条件下。分析时不要使用第一天的测量数据。进行恒定黑暗实验时，首先将果蝇在明暗条件下饲养两天，以使生物钟同步，随后转入恒定黑暗环境。

分析时请勿使用恒定黑暗第一天的测量数据。在进入下一节之前，我们建议您阅读本方案。监测系统将输出一个包含监测仪中所有果蝇活动数据的单一文件。

输出文件的最后 32 列包含单个果蝇的活动数据。我们的程序处理单个果蝇的活动，因此需将输出文件拆分为多个单果蝇活动文件。

每个文件应为单列的 TXT 文件。现在，在准备好活动文件后，我们可以运行分析。在 MATLAB 命令窗口中使用以下输入参数运行 ModelFitPS3 函数。

采样率，请输入数据采样时间间隔（单位为秒）。例如，我们的数据以20秒的采样率采集，因此在此处输入20。

在“bin interval”中输入以分钟为单位的时间间隔，用于将数据分段汇总，以便更清晰地可视化。我们建议将时间间隔设为20或30分钟，但此处我暂且输入10，以便稍后向您展示如何轻松修改该设置。对于“trend”，如果数据显示出基线趋势，则输入1，否则输入0。

我们的数据没有任何基线趋势。因此，我在此处输入零。按 Enter 键运行该函数。

在弹出窗口中选择单个果蝇活动文件，然后点击“打开”。程序将计算并绘制数据的功率谱。在此窗口中，确定数据中的主要周期。

为此，可使用鼠标左键单击昼夜节律周期处的峰，或使用鼠标右键单击第二谐波处的峰（该峰大约位于昼夜节律周期除以2的位置）。在本例中，第二谐波处的峰明显比昼夜节律周期处的峰更高且更尖锐。因此，我们采用第二种方法。

然后，程序将按照选定的区间对数据进行分组并绘图。如您所见，在10分钟的分组区间下，早晨和傍晚的峰值并不十分明显。因此，我们需要更改此数值。

为此，只需在图表上的任意位置单击右键。在新出现的对话框中，输入新的区间值。我们建议将时间间隔设置为 20 分钟。

因此，我们在此处输入 20。点击“确定”。程序会立即使用新的区间宽度重新绘制数据。要接受此值，只需在图表的任意位置单击鼠标左键即可。

程序现在将重新绘制数据，并仅显示五天的测量结果。在此窗口中，选择将用于分析的第一个早晨峰。有时需要跳过最初一到两天，以使果蝇适应光暗循环。

要选择早晨的峰值，只需单击首选的峰值即可。程序将重新绘制数据，此时仅显示从所选早晨峰值开始的三天测量结果。蓝色和红色的垂直线表示基于第一个窗口中所选时间段的第一个傍晚峰值和第二个早晨峰值。

在此窗口中，选择用于通过模型函数对数据进行初步拟合的管状图上的点。具体操作顺序如下：首先，单击第一个早晨峰的顶部。

点击位置以底部的红色星号标示，显示点击的位置。然后依次点击早晨峰的结束处、傍晚峰的开始处、傍晚峰的顶端、傍晚峰的结束处，最后点击第二天早晨峰的顶端。由于最终参数由谱拟合获得，程序将再次绘制功率谱。

当前谱图以频率为横轴，昼夜节律峰位于图的左侧。第一步确定的周期以一条红色垂直线标出。为了选择拟合点，首先大致确定主周期。

为此，可选择左键单击昼夜节律周期处的峰，或右键单击第二谐波处的峰。我们将再次使用第二种选项。之后，底部将出现一个滑块，用于选择光谱拟合的点。

这些点将以红色圆圈显示，并在移动滑块后出现。左右移动滑块，将各点尽可能贴近谱峰的峰顶。当获得最佳图像后，按下“接受”按钮，程序将使用模型功率谱的解析表达式对所选点进行拟合。

拟合完成后，程序将输出另外两个图表。第一个是使用提取的参数构建的模型的功率谱。第二个是用该模型拟合的数据。

数据以黑线表示，模型以红线表示。可以看出，该函数与数据非常接近，尤其是活动的最后三天。提取的参数已保存至模型拟合参数 TXT 文件中。

文件名之后，参数按以下顺序保存：首先是早晨衰减的 b 值，然后是早晨上升的 b 值、傍晚上升的 b 值、傍晚衰减的 b 值、昼夜节律周期，接着是早晨峰宽除以昼夜节律周期，傍晚峰宽除以昼夜节律周期，早晨峰高，傍晚峰高，以及频谱拟合的拟合误差。除了模型拟合参数文件外，程序还将输出另外两个文件：第一个是数据与模型函数的拟合结果，第二个是频谱拟合结果。

使用其他活动文件执行此分析。所有提取的参数将保存至模型拟合参数 TXT 文件中，可用于进一步关联行为输出与调控果蝇日常行为的潜在机制，这些机制由模型活动模式所控制。