Drosophila 免疫应答与睡眠的定量测量

以下实验的总体目标是评估果蝇的睡眠与免疫功能。首先通过记录感染后果蝇的运动活动来测量其睡眠和存活率；感染后的第二步是将果蝇匀浆、稀释后涂布于LB琼脂平板上，通过计数生长的菌落形成单位数量来评估果蝇清除感染的能力。

随后，将表达含有 NF-κB 荧光素酶报告基因的转基因的感染果蝇加入含有荧光素（luciferin，荧光素酶的底物）的 96 孔板中。对 κB 荧光素酶进行实时检测，可指示感染过程中 NF-κB 信号通路的激活情况，从而综合反映睡眠与存活结果。细菌清除能力与 NF-κB 报告基因活性是两项能够揭示免疫功能与行为之间分子关联机制的检测指标。

通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为学习如何稳定地手动感染果蝇需要时间和练习。与现有的 QPCR 等方法相比，荧光素酶报告技术的主要优势在于，可以在活体果蝇中连续、实时地检测 NF-κB 活性。实验开始时，将处于晚期蛹期的黑腹果蝇培养物在培养箱中孵育三至四天，以使成虫适应环境条件。

此处将果蝇置于持续光照条件下，以消除昼夜节律对免疫反应和行为的影响。随后将一至四日龄的果蝇装入活动监测装置中。在预定感染前一天，监测仪记录其至少三天的活动情况。

用无菌移液器吸头挑取单个 SIA 菌落，并将吸头浸入含有 5 mL LB 培养基的培养管中，以验证无菌操作技术。切勿忘记制备不含细菌的对照空白培养物。将细菌培养过夜，直至次日达到对数生长期。

在600纳米处测定培养物的吸光度。以第二个Q vet作为空白对照。当浓度达到0.5至1个吸光度单位时，即可进行转接培养；必要时可延长培养时间。

现在准备用于感染果蝇的细菌溶液。用 PBS 将细菌稀释至在 600 纳米处的预期吸光度为 0.1。然后加入食用色素作为注射对照。

用LB培养基替换细菌，并将两种溶液均置于冰上保存。接下来，在解剖显微镜下使用微量移液器拉针仪制备具有细尖端的注射针。

使用精细镊子折断每根针的尖端，使开口足够大，能够通过抽吸填充注射液，但又足够小，以尽量减少对果蝇的损伤。将玻璃针通过一段软管连接到一个3 cc的塑料注射器上，使用该注射器手动控制注射液的流动。

使用注射器装置进行感染性和对照性注射时，应避免注射液污染橡胶管。使用Kimwipe纸巾检查注射介质的流动情况。成功注射的两个关键细节是使用最佳针头尺寸以及针头与注射器之间严密的密封。

注射系统完全准备好后，使用最小流量的二氧化碳对果蝇进行麻醉，并迅速操作，确保果蝇麻醉时间不超过五分钟。通过将玻璃针插入背部胸部斜片区域上方进行注射。注射过程中可通过食用色素观察注射液在果蝇体内的扩散情况，以确认注射介质已进入果蝇体内。

开始之前，务必确保本实验所使用的所有材料已在至少一天前经过高压灭菌。准备含有LV琼脂培养基的10厘米培养皿。实验当天，将果蝇麻醉后放入1.5毫升离心管中。

每种实验条件下至少准备两组果蝇，每组10只。同时准备未感染的果蝇对照组，尤其是在使用无抗生素抗性的菌株时。将所有装有果蝇的试管置于冰上保存。

接下来，向每管加入果蝇的离心管中加入 400 µL LB 培养基。使用小型研磨杵在火焰附近匀浆果蝇，以防止污染。然后使用剪去尖端的移液枪头，将匀浆液用 200 µL 体积进行 10 倍系列稀释。

若在感染 sia 后立即制备匀浆液，则将稀释度配制为 1 至 1000；而对于感染后 24 小时的匀浆液，则将稀释度配制为 1 至 100,000。接下来，使用玻璃珠将最大的两个稀释度接种至 10 厘米培养皿中，以确保均匀分布，并将培养皿过夜培养。次日，通过直接观察或菌落计数软件统计培养皿上的菌落数量。

然后计算每只果蝇的菌落形成单位数量。该实验采用在适当时间携带κB荧光素酶报告基因的转基因果蝇。实验还需要培养细菌，例如按照前一节所述方法制备用于注射的SCIA。

将果蝇调整至实验光照条件下。在此示例中，将一至四日龄的kappa b荧光素酶果蝇饲养于含有5%蔗糖和2%琼脂食物培养基的小瓶中，并置于持续光照条件下两天。现在为果蝇准备一块96孔微孔板。

每个孔中加入两层食物。先加培养基，向每个孔中加入300微升5%蔗糖、2%琼脂溶液。然后用细网布覆盖培养板，并静置干燥至多1小时。

接下来，向每个孔中加入50微升顶层，其中含有5%蔗糖、1%琼脂和2毫摩尔的Lucifer。由于Lucifer对光敏感，此后让培养板在避光条件下干燥，并尽量减少培养板的光照暴露。

琼脂冷却后，用透明粘性薄膜覆盖平板。然后使用细针在每个孔上方的薄膜上穿刺两个小孔。这些小孔可实现气体交换和气体麻醉。

接下来，为了便于装载果蝇，使用锋利的刀片和直边在每列之间切开一条缝隙。用二氧化碳麻醉果蝇，并逐个将果蝇按列依次装入各孔中。如果果蝇粘附在膜上，应先让其有机会自行挣脱，再进行干预。

将微孔板放回培养箱中，在持续光照条件下孵育8至24小时。使用连接低压二氧化碳气源的微量移液器吸头对孔中固定的果蝇进行麻醉。确保气体压力处于无害的低水平，并将微量移液器吸头直接置于通风孔上方，逐批对每组八只果蝇进行单独麻醉。

将每只果蝇转移至 CO2 垫上，并按照先前方法用细菌感染。然后将每只果蝇放回其原始孔中，并重新密封微孔板。在温度受控且具有特定光照周期的房间内，使用化学发光仪测量每只果蝇的发光量。

将培养板装入堆叠式盒中，确保将含有果蝇的培养板夹在透明的空白板之间。根据制造商的说明设置光度计程序，并至少连续每小时采集一次读数，持续至少24小时。在本示例中，检测器被设定为对每个孔读取10秒。

完成后，将数据文件导出至电子表格，并对结果进行标准分析绘图。可对示例数据进行分析。每孔取三次读数，计算每秒平均折扣值。

将Canton S野生型果蝇和缺乏NF kappa B基因的relish.E20突变体果蝇分别装入两台活动监测仪中，在持续光照条件下感染sia。在此示例中，感染促进了睡眠。

显然，relish E 20 突变体果蝇在感染后比Canton s对照组果蝇睡眠更少。与先前的研究结果一致，与野生型果蝇相比，relish E 20 突变体在感染后也迅速死亡。

大多数果蝇在无菌对照注射后存活，表明果蝇的死亡是由于感染所致，而非注射造成的损伤。由于relish突变体死亡速度过快，因此仅使用Canton s品系果蝇来展示感染后的细菌载量。感染24小时后，Sia在果蝇体内持续增殖。

荧光素酶报告基因活性在个体果蝇之间以及数据点的成功率之间表现出较大差异。尽管信号来源于果蝇体内的所有组织，但并非每种组织都会发出相同强度的信号，且当果蝇移动时，组织对检测器的可见性也会发生变化。在本示例中，果蝇被感染后与经过相同操作的对照组进行了比较。

死亡的果蝇在群体分析中被排除。感染后，Kappa b 萤光素酶报告基因活性持续上升。无菌性损伤后，Kappa b 萤光素酶报告基因活性也持续升高。

损伤后和感染后的活动高峰均约为12小时。观看本视频后，您应能充分理解如何在感染后定量评估SSO中的免疫功能和睡眠。我们可以测量睡眠、存活率、时间、细菌清除率以及未复制转录报告基因的实时活性。