在无异种成分条件下将原代羊水及羊膜细胞重编程为多能性状态

本实验的总体目标是通过附加体质粒重编程技术，从两种不同类型的胎儿干细胞中高效地获得诱导性多能干细胞。该方法可为组织工程、疾病建模、基础研究或纵向研究提供多能干细胞来源。该技术的主要优势在于，诱导性多能干细胞的重编程及成熟过程均在化学成分明确的条件下进行，且可较早地用于潜在的儿科细胞治疗。

演示该实验步骤的将是首席研究员 Steven McClellan 和我本人。出生后应尽快获取胎盘。剪取9平方厘米的羊膜片段，置于50毫米离心管中，用30毫升含抗生素和抗真菌剂的PBS溶液洗涤。

去除膜上的血凝块，然后用一对精细的手术刀在无菌的10厘米组织培养皿中将膜切碎成细小碎片。使用刀片将切碎的膜组织转移至一根组织解离管中，管内含有4.7毫升RPMI-1640培养基。加入解离酶并混匀。

将试管安装到组织解离仪上，运行程序 h_tumor_01。随后将试管置于摇床上，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。再用 35 毫升 RPMI-1640 进一步稀释悬液，并转移至置于 50 毫升离心管上方的 70 微米细胞筛中。

在室温下以200 × g离心五分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于5 mL RPMI-1640培养基中，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞以每平方厘米约10,000个细胞的密度接种至组织培养瓶中，培养瓶中加入新配制的含抗生素和抗真菌溶液的AFMC培养基，细胞以细胞簇形式接种。

从一个T75培养瓶中收获低传代次数的羊水和羊膜干细胞用于重编程：向细胞层加入两毫升细胞解离酶，37摄氏度孵育5至8分钟。在200 × g离心45分钟后，将沉淀重悬于一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分混匀以去除血清成分。

使用血细胞计数板对细胞进行计数。然后将细胞浓度调整为每毫升 PBS 含 100,000 个细胞，并分装至 1.5 毫升微量离心管中。将微量离心管放入 5 毫升聚苯乙烯管中，以便在常规摆动转子离心机中进行离心，于室温下以 200 × g 离心 4 分钟。

离心后，将离心管倒置，弃去上清液至废液容器中，随后以200 × g再次离心3分钟。离心后，使用200微升移液器小心吸除管中残留液体。将转染枪头、离心管、重悬缓冲液和电转缓冲液放入组织培养柜中。

将转染装置移近，使其管架可以直接放入生物安全柜内。取一支转染管，加入三毫升电转缓冲液，并将该管完全推入管架的插槽中固定。从零下80摄氏度冰箱中取出预先分装好的重编程质粒溶液，置于细胞培养柜内室温条件下解冻。

将电转染参数设置为在950伏特下传递一个持续40毫秒的脉冲。用10微升重悬缓冲液重悬含有100,000个细胞的沉淀。迅速操作，将重编程质粒溶液的1/10加入重悬的细胞中。

将转染枪头安装到转染移液器上。然后小心吸取细胞悬液，避免产生气泡。将转染移液器插入转染管中。

然后按下转染仪屏幕上开始按钮。等待屏幕显示转染成功的信息。随后立即将移液器从离心管中取出。

将悬液加入目的六孔板中的一个孔内。混入邻近孔中的培养基，并将悬液均等地分配至两个孔中。对每根含有细胞的微量离心管重复转染操作。

首先，在五个 PCR 管中各加入 30 微升 0.5 毫摩尔的 EDTA 和 PBS。然后将枪头装到设定为 2 微升的 10 微升移液器上。将移液器枪头以一定角度置于菌落边缘，小心并缓慢地将整个菌落从表面刮下。

立即将整个菌落吸入移液枪头中，并转移至含有EDTA的预置PCR管中。对另外四个菌落重复此操作后，在室温下孵育4至6分钟。使用较大的移液枪头，轻轻吹打每种细胞悬液，上下移液，以将菌落分解成较小的团块。

避免制备单细胞悬液。随后将悬液直接接种至经重组纤连蛋白包被的24孔板的目标孔中。对剩余的克隆重复此操作后，于3至6天内进行培养。

培养四到六天后，当菌落生长并变得致密时，用 300 微升 0.5 毫摩尔 EDTA 洗涤细胞层，并立即吸除。然后加入另外 300 微升 EDTA，在室温下孵育五分钟。吸除 EDTA 后，将一支 1 毫升移液器调至最大容量，装上 1 毫升宽口吸头，从包被有纤连蛋白的六孔板的目标孔中吸取 E8 培养基。

将培养基以细流状喷射至来源培养板的一个孔中，以冲洗下iPSC细胞。然后将细胞悬液转移至目标孔中，并反复吹打数次，使细胞集落分散成含有20至40个细胞的团块。接种所有细胞后，轻轻摇动和晃动培养板，确保细胞团块均匀分布。

然后将培养板放回培养箱中，以促进细胞团的贴附和克隆生长。羊水及羊膜来源的干细胞作为重编程的起始细胞，具有典型的间充质细胞形态，呈长梭形且折光性强。当这些细胞经历间充质-上皮转化后，会获得上皮细胞特性，进而形成由铺路石样细胞组成的克隆集落。

这些集落增殖并形成不规则的MET细胞团块。在重编程的后期阶段，完全重编程的细胞集落出现，表现为边界清晰、可单独分辨的细胞。这些完全重编程的细胞与数量更多的MET集落共存。

此处展示的是一个完全重编程的分离成熟克隆。在诱导多能干细胞（iPSC）的获得和成熟后，可对其进行详细表征，并进一步定向分化为多种细胞类型。请务必注意，操作未经病原体检测的人体组织可能具有极高危险性，因此在进行该实验操作时，必须采取个人防护装备以及在生物安全柜内操作等预防措施。

观看本视频后，您应能够充分理解如何诱导胎儿干细胞产生多能性，了解所需的试剂和设备，以及如何常规培养多能干细胞。