基于RNA的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

由于其高效率，该方法可进一步推动诱导性多能干细胞（IPSCs）作为研究人类疾病和开发新型干细胞疗法的工具。本方案的主要优势在于能够从原代人成纤维细胞中生成高质量的无整合IPSCs，包括难以重编程的、与疾病相关的、衰老的以及衰老相关的成纤维细胞。该方法的成功取决于成纤维细胞中RNA转染效率的最优化。

调整转染缓冲液的pH值是实现这一目标的关键步骤。首先，使用500毫升和100毫升室温预热的新鲜低血清培养基来配制转染缓冲液。将pH计的玻璃电极插入500毫升瓶中的培养基，测量其基础pH值，并等待最多一分钟后再读取pH值。

为调节 pH 值，向 500 毫升瓶中加入三到四毫升 1 摩尔氢氧化钠。盖紧瓶盖并充分混匀。等待五分钟后，打开瓶盖，将 pH 计的电极插入缓冲液中。

等待 pH 计读数稳定。继续加入少量 1 摩尔氢氧化钠，直至 pH 达到 8.15 至 8.17，确保在此过程中多次校准 pH 计。使用 0.22 微米真空过滤系统对转染缓冲液进行过滤除菌。

将灭菌缓冲液分装至5毫升离心管中，尽量减少管内气空间。确认待重编程的成纤维细胞融合度为40%至60%。将4毫升DPBS转移至15毫升锥形管中，并加入100微升重组人层粘连蛋白521。

用移液器上下吹打充分混匀。将稀释后的重组人层粘连蛋白521每孔1毫升加入六孔板中的三个孔内。将包被好的培养板于37°C孵育2小时。

在孵育期间，将6毫升成纤维细胞扩增培养基和4毫升铺板培养基预热至37摄氏度。向铺板培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），使其终浓度为100纳克/毫升，并加入B18R，使其终浓度为200纳克/毫升。小心吸除处于40%至60%融合度的成纤维细胞的旧培养基。

用五毫升 DPBS 清洗细胞。加入三毫升胰蛋白酶 EDTA，轻轻摇动培养板，使胰蛋白酶 EDTA 覆盖细胞。吸去多余液体，保留约 500 微升胰蛋白酶，将成纤维细胞在 37 摄氏度下孵育三分钟。

从培养箱中取出培养板后，用力但小心地轻敲培养板侧面，使细胞脱落。在显微镜下观察细胞，检查其是否已脱离。向脱落的细胞中加入5 mL成纤维细胞扩增培养基，以中和胰蛋白酶EDTA。

将细胞收集到一个15毫升的锥形管中，并充分混匀。使用血细胞计数板对细胞进行计数，然后用移液器将12,000个细胞加入4毫升预先配制并预热的铺板培养基中。从培养箱中取出包被好的培养板后，吸去孔中的稀释层粘连蛋白521，注意确保孔的表面不干燥。

轻轻重悬处于铺板培养基中的细胞，并将1 mL细胞悬液加入每个包被好的孔中。将接种好的细胞放入三气组织培养孵箱中，在低氧或5%氧气条件下培养。然后通过上下移动和左右移动交替的方式，轻柔而充分地分散细胞，重复此动作两次，注意不要旋转混匀培养板。将细胞过夜培养。

同时，向一个15毫升的锥形管中加入4毫升重编程培养基，并将管盖稍拧松，放入低氧培养箱中过夜平衡。转染前至少一小时，从低氧培养箱中取出已平衡的重编程培养基。加入bFGF至终浓度为100纳克/毫升，以及B18R至终浓度为200纳克/毫升，充分混匀。

每次操作一个孔，使用1 mL移液器吸出用过的培养基，并加入1 mL重编程培养基，其中添加bFGF和B18R。将含细胞的培养板放回低氧培养箱中。

开始成纤维细胞转染时，首先将一份转染缓冲液在室温下平衡约一小时。从负80摄氏度取出一份33微升的修饰mRNA和一份14微升的MIRNA模拟物，置于室温下解冻约三至五分钟，直至完全融化。然后在微量离心机中短暂离心。

将转染试剂置于室温下预热约三到五分钟。轻轻倒置管子两到三次以混匀试剂，并在微量离心机中短暂离心。取279 µL室温转染缓冲液加入无RNA酶的微量离心管中，再加入31 µL转染试剂。

用移液器充分混匀，室温孵育1分钟。向33微升修饰后的mRNA等分试样中加入132微升室温转染缓冲液，轻轻移液混匀。向14微升miRNA模拟物等分试样中加入102.6微升室温转染缓冲液，轻轻移液混匀。

配制修饰mRNA的转染混合液时，将310微升转染缓冲液-转染试剂混合液中的165微升加入到165微升转染缓冲液-修饰mRNA混合液中。用移液器吹打混匀。配制miRNA模拟物的转染混合液时，将310微升转染缓冲液-转染试剂混合液中的116.6微升加入到116.6微升转染缓冲液-miRNA模拟物混合液中。

充分混匀后，在室温下孵育15分钟，使转染缓冲液与修饰的mRNA和miRNA模拟物形成复合物。从低氧培养箱中取出细胞培养板。将含有复合物的修饰mRNA转染混合液逐滴加入每孔，每孔100 µL。

轻轻但彻底地上下移动，然后左右移动培养板，以充分分散转染复合物。将含有复合MIRNA模拟物的转染混合液逐滴加入每孔，每孔66.7微升。轻轻但彻底地上下移动，然后左右移动培养板，以充分分散转染复合物。

将转染后的细胞培养板放入低氧三气培养箱中。通过轻柔但彻底地上下、再左右晃动培养板，使转染复合物均匀分散。将转染后的细胞在培养箱中孵育16至20小时，然后于次日更换培养基。

向一个15毫升锥形管中加入4毫升重编程培养基，管盖松开后置于低氧培养箱中过夜平衡。次日早晨，将含有转染成分的培养基更换为新鲜的、预先平衡过的、添加了bFGF和B18R的培养基，并按照方案所述继续进行转染程序。成功接种至六孔板中的一孔进行重编程后，成纤维细胞呈现非常稀疏的状态。

首次成功转染后24小时，成纤维细胞失去了梭形形态，转而呈现更圆润的形状。在前三次转染过程中，细胞密度逐渐且持续增加，并在第7至第8天之间出现明显的增殖高峰。到第10天时，细胞已基本达到汇合状态。

最早的iPSC集落早在第11天即出现。至第15至17天，iPSC集落变得较大且明显，与周围未完全重编程的成纤维细胞清晰可辨。对多能性标志物TRA-1-60进行免疫染色，证实了较高的重编程效率。

接种密度不理想是本实验方案中重编程效率降低的最常见原因。若接种密度过低，则会出现较大的无细胞空白区域，且无法形成诱导多能干细胞（iPSC）克隆。在对重编程细胞进行稀释传代后，iPSC以单个克隆的形式生长，并可轻松与成纤维细胞区分开来。

它们呈松散排列，单个细胞具有相对较大的细胞质区域。在4至7天的过程中，诱导多能干细胞（iPSCs）增殖并形成具有明确边界的典型紧密排列克隆。克隆内的单个细胞显示出较大的核质比例，并具有明显的核仁。

在对患者成纤维细胞进行重编程后，所获得的诱导多能干细胞（IPSCs）可分化为多种体细胞，以阐明致病机制或开发新型再生细胞治疗手段。