一种基于过滤法的交联骨骼肌细胞核高质量制备方法，用于染色质免疫沉淀

本实验方案的总体目标是制备高质量的交联骨骼肌细胞核，可用于染色质免疫沉淀研究。该方法有助于回答肌肉生物学和昼夜节律领域中的关键问题，例如在昼夜节律或其他时间敏感的背景下利用肌肉组织和细胞进行基因组学研究。该技术的主要优势在于能够对样本进行即时交联，且基于过滤的步骤可稳定地分离出高质量细胞核，最大程度减少肌原纤维污染。

尽管该方法可用于研究骨骼肌，但也适用于其他系统，如心肌和平滑肌。按照先前所述方法，称重并切碎从约20周龄C57黑六雄性小鼠分离的后肢骨骼肌组织，操作过程在冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中进行。将切碎的骨骼肌组织放入含有10毫升PBS的50毫升锥形管中，并置于冰上。

然后在4°C条件下以300 × g离心样品5分钟。小心地通过抽吸去除PBS上清液。使用分别装有1、2、3和4毫升水的对照管，估测每个50毫升管中沉淀物的体积。

加入七倍体积的预冷的含1%甲醛的PBS溶液，在冰上使用探头式组织匀浆器对样品进行匀浆。接着，将样品在室温下孵育10分钟以进行交联反应。通过加入1摩尔浓度的甘氨酸至终浓度0.125摩尔，终止交联反应，随后在室温下孵育5分钟。

在4°C条件下，以3,000 × g离心样品5分钟，随后通过抽吸去除上清液。用含有新鲜添加的蛋白酶抑制剂的10毫升冰预冷的基础缓冲液重悬沉淀，以清洗沉淀。再次离心样品，并小心通过抽吸去除上清液。

然后将沉淀重悬于6 mL含有新鲜添加的蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。将样品转移至预冷的15 mL Dounce匀浆器中，冰上孵育10分钟。在冰上对每个样品进行Dounce匀浆，先用松动研杵缓慢研磨15次，再用紧密研杵研磨15次，以释放细胞核。

以下过滤步骤是分离高质量细胞核的关键。将匀浆液通过细胞滤筛过滤，并用四毫升裂解缓冲液冲洗。然后在四摄氏度下以1,000 × g离心10分钟。

将沉淀重悬于5 mL冰上预冷的基础缓冲液中，使用紧密研杵Dounce匀浆10次，以释放细胞核。随后通过细胞滤筛过滤悬浮液，并用2 mL基础缓冲液冲洗离心管，再次过滤。依次使用孔径逐渐减小的细胞滤筛重复过滤过程。

最后，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 500 µL 基础缓冲液中，然后再次离心。弃去上清液，将沉淀物保存于 -80 °C。

在500微升SDS裂解缓冲液中解冻样品，并用移液器轻轻吹打重悬。将细胞核DNA悬液转移至冰上的玻璃小瓶中。选择合适的超声破碎平台和条件对于从分离的细胞核中制备染色质至关重要。

使用文本方案中所述的设置，通过盘状换能器发出的聚焦超声波能量进行超声处理。将超声处理后的染色质转移至1.5毫升离心管中，然后在12,000 ×g离心15分钟，并将上清液转移至新的离心管中。

接下来，将50微升超声处理后的样品转移至新的1.5毫升离心管中，在65摄氏度下过夜进行逆转交联。DNA样品的回收将在下一部分中描述。根据文本方案中所述的超声处理效果评估与定量结果，将解冻的染色质分装至每管约100至120微克。

然后用免疫沉淀缓冲液将染色质稀释至原来的十分之一。接着加入40微升50% BSA预封闭的蛋白HE琼脂糖或IgY磁珠悬液，在4°C下旋转孵育3小时。在1,000 × g离心10分钟后，小心将上清液转移至新的离心管中。

然后加入抗体，每25至100微克染色质DNA加入一微克抗体。在4°C、约15 rpm条件下轻柔旋转孵育过夜。随后加入10微升BSA预封闭的蛋白HE琼脂糖或IgY磁珠，混匀。

在冷室中旋转孵育珠子悬浮液两小时。随后，按照文本方案中的说明，依次使用RIPA缓冲液、高盐缓冲液、氯化锂缓冲液和Tris EDTA缓冲液洗涤珠子。洗涤后，先以1,000 × g离心一分钟，小心移除上清液，从而将DNA从珠子中洗脱出来。

用50微升洗脱缓冲液重悬珠子，然后在65摄氏度孵育10分钟。孵育结束后，在12,000 ×g 离心5分钟。

移除上清液，再加入 50 微升洗脱缓冲液，然后在 12,000 × g 条件下再次离心 5 分钟。最终洗脱体积为 100 微升。为逆转交联并进行 DNA 洗脱，首先将洗脱的染色质在 65 摄氏度下孵育过夜。

然后加入1 µL RNase A，在37°C下孵育30分钟。随后加入8 µL浓度为10 mg/mL的蛋白酶K，在55°C下孵育30分钟。按照制造商的说明书，使用PCR纯化试剂盒进行DNA回收，洗脱体积为50 µL。

最后，按照先前所述方法，通过实时定量PCR分析这些谱型。连续过滤可有效去除组织碎片。此处展示了初始过滤后和连续过滤后样品的代表性图像，以供比较。

通过琼脂糖凝胶电泳显示，经过10个循环的超声处理后，染色质逐步被剪切。经消化的染色质进行10个循环的超声处理后，得到约500个碱基对的DNA片段。此处展示了在ZT6和ZT18时间点采集的小鼠骨骼肌样本中，B型雄性个体一次染色质免疫沉淀实验的代表性qPCR结果。

对 Dbp 基因上 Dbp 位置元件的分析显示，其结合峰位于 ZT6 左右，与先前的研究结果一致。一旦掌握该技术，若操作得当，可在五到六小时内完成细胞核的制备。观看本视频后，您应能充分理解如何利用基于过滤的方法，从交联的肌肉组织中纯化高质量的细胞核和染色质 DNA。

在进行该实验操作时，重要的是始终将样品置于冰上或冷室中，并在过滤步骤前后保留部分样品用于显微镜检查。该技术建立后，为肌肉与基因组学领域的研究人员探索不同肌肉组织中染色质-蛋白质相互作用的昼夜节律或时间依赖性动态变化奠定了基础。在完成该操作后，可进一步采用如染色质免疫沉淀测序（chIP-seq）等其他方法，以回答更多科学问题，例如分析转录因子在肌肉组织中的结合模式。