小鼠骨骼肌染色质免疫沉淀实验的优化方案

本实验的总体目标是从成年小鼠骨骼肌中制备染色质。该方法有助于回答基因调控和骨骼肌纤维领域的关键科学问题。该技术的主要优势在于，能够从小鼠骨骼肌中制备适用于染色质免疫沉淀（ChIP）的染色质。

一种具有高含量结构蛋白的物理抗性组织。我们最初产生该方法的想法是源于需要阐明葡萄糖关节相关性肌肉萎缩的分子机制，这要求鉴定小鼠骨骼肌纤维中葡萄糖关节受体及其DNA结合位点。本实验操作将由本实验室的博士后Shilpy Joshi进行演示。

开始此操作时，取冷冻或新鲜解剖的后肢肌肉。随后，在含有1毫升冰上预冷的低渗缓冲液的2毫升试管中，用精细剪刀将肌肉剪切成均匀的小块。之后，将试管置于4摄氏度的台式振荡器上振荡5至10分钟。

接下来，将解剖得到的组织转移至含有 4 毫升冷低渗缓冲液的 14 毫升圆底管中。使用机械组织匀浆器将剪碎的组织匀浆 15 至 30 秒。随后，将匀浆液转移至 15 毫升离心管中。

加入冷的低渗缓冲液，使样品总体积达到10毫升，并在继续处理下一只小鼠前固定匀浆。在此步骤中，向样品中加入甲醛，使其终浓度为1%。然后在室温下振荡10分钟。

接着，加入甘氨酸，使每管中甘氨酸的终浓度为 0.125 摩尔，以终止固定反应。然后在室温下振荡 5 至 10 分钟。之后，使用松散研杵的玻璃匀浆器对固定的裂解液进行匀浆处理。

然后，将样品转移至15毫升离心管中，在4摄氏度下以1000 g离心5分钟，以获得细胞核和细胞碎片。离心5分钟后，弃去上清液，并将沉淀物重悬于5毫升新鲜的低渗缓冲液中。将裂解液通过70微米细胞滤筛过滤至50毫升离心管中。

使用移液枪枪头，用一毫升冷低渗缓冲液冲洗滤膜。随后，将滤液通过40微米细胞筛再次过滤。接着，将滤液转移至15毫升离心管中。

在4°C条件下以1000 × g离心5分钟，以获得细胞核沉淀。弃去上清液后，加入1毫升低渗缓冲液重悬合并三个沉淀，并转移至1.5至2毫升离心管中。再以1000 × g离心5分钟。

接下来，通过与含有已知体积液体的离心管进行比较，评估核沉淀的体积，并将其重悬于超声破碎缓冲液中，体积为压紧核体积的三到四倍。随后，使用超声破碎仪在4摄氏度条件下对悬液进行10至15分钟的超声处理。将超声处理后的样品离心，并将染色质上清液转移至新的1.5毫升离心管中。

为进行解交联，取30微升染色质置于1.5毫升离心管中，加入20微升5摩尔氯化钠和450微升水。加水至终体积为500微升，于65摄氏度孵育过夜。次日，在42摄氏度条件下，加入1微升蛋白酶K、10微升2摩尔pH 6.8的Tris溶液和10微升0.5摩尔EDTA处理1小时。

然后，进行常规的苯酚-氯仿抽提，加入一倍体积的乙酸钠和两倍体积的100%乙醇，在-80°C下放置一小时或在-20°C下过夜以沉淀DNA。接着，在13,500 ×g离心15分钟以收集DNA沉淀。弃去上清液，用预冷的70%乙醇彻底洗涤沉淀，并再次离心5分钟。

然后倾去上清液，将沉淀物风干。接着用原始体积的Tris-HCl-EDTA缓冲液重新悬浮沉淀物。使用分光光度计在260纳米和280纳米波长下测定DNA浓度。

随后，将500至1000纳克的DNA与DNA分子量标准品分别加入1.5%琼脂糖凝胶的不同泳道中，并进行电泳以评估染色质片段的大小。为优化实验条件，分别在18,000和22,000转/分钟两种转速下，进行15秒或45秒的匀浆处理。

在所有条件下，均可将细胞核与组织碎片分离，但使用较低转速时得率最佳。也可通过吹打3至5分钟来制备细胞核。然而，机械匀浆是首选方法，因为仅需15秒即可获得最佳的细胞核得率，从而显著节省时间，特别是在需要处理多个样本的情况下。

采用本方案，可从500毫克组织中分离出最多达2.7 × 10⁷个细胞核，以生成100微克染色质。以此方法制备的染色质在ChIP测序实验中可获得清晰且高质量的结果，如在肌肉表达的Desmond基因座处，组蛋白H3的K27乙酰化水平和RNA聚合酶2的富集情况所示。

通过Pecam1和Vcam1位点处信号较低或无信号可证明对肌纤维的特异性，因为这些基因在肌肉中不表达。在进行该实验时，需注意将匀浆探针完全浸入样品中以避免产生泡沫，样品之间应清洁探针，并优化染色质片段化条件。采用此方法制备的染色质已成功用于ChIP实验，以绘制全基因组转录因子结合图谱，同时也适用于染色质构象捕获技术。

该技术建立后，为基因组学领域的研究开辟了道路，可用于探索小鼠骨骼肌中的基因调控。该方法也可应用于大鼠肌肉以及人类患者的肌肉活检样本。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过机械匀浆法，随后纯化甲醛固定的细胞核，以制备适用于免疫沉淀的骨骼肌染色质。

请注意，使用甲醛、苯酚、氯仿和蛋白酶K可能存在危险。应采取预防措施，例如佩戴手套和护目镜。涉及这些试剂的操作应在通风橱内进行。