患者胶质母细胞瘤切除组织中细胞微环境的定量免疫组织化学分析

本方案的总体目标是利用显色免疫组织化学和ImageJ对胶质母细胞瘤患者切除样本中的肿瘤微环境组分进行定量鉴定。该方法有助于回答肿瘤微环境研究领域中的关键问题，例如这些组分在患者样本中的形态特征，以及我们如何确定具有生理相关性的细胞比例。该技术的主要优势在于其对患者样本的分析操作简便。该技术的应用前景在于揭示目前尚未充分表征的复杂胶质母细胞瘤肿瘤微环境。

通常，初次接触该方法的人员可能会遇到困难，因为显色反应的时机需要密切监控，以防止组织过度显色和信号饱和。首先按照配套文本方案中指定的步骤进行洗涤操作。根据生产商的建议，用蒸馏水稀释基于三羟甲基氨基甲烷的高 pH 值抗原修复液。

将稀释的去封闭溶液加入一个非密封的可微波容器中，进行热介导的抗原修复。将切片放入容器内，然后将装有切片的容器放入微波炉中。

接下来，将容器在高功率下煮沸 20 分钟。监测液体蒸发情况，并根据需要补充蒸馏水。让样品在溶液中于室温下冷却 1 小时。

使用疏水笔勾画组织样本轮廓，以尽量减少覆盖样本所需的试剂体积。然后加入足够的通透化溶液，用量为100至200微升，以完全覆盖组织样本。移除并弃去溶液，再次用通透化溶液覆盖组织样本。

将样品在室温下用封闭液孵育一小时。然后，在4°C条件下，将样品与用封闭液稀释的一抗共同孵育过夜。次日，使用与一抗宿主动物对应的辣根过氧化物酶聚合物试剂检测一抗。

加入足量的通透化溶液以完全覆盖组织样本，孵育5分钟。移除并弃去溶液，再次用通透化溶液覆盖组织样本，继续孵育5分钟。将切片置于0.3%过氧化氢和1×TBS中，孵育15分钟。

使用过氧化物酶二氨基联苯胺（dab）底物孵育样本2至10分钟，直至达到理想的染色强度。对样本进行复染以识别细胞核，例如根据制造商说明书使用苏木精染色。用100%乙醇和二甲苯对样本进行脱水处理。

最后，使用封片介质对样本进行永久封片。在我们的肿瘤切除样本中，经合作神经病理学家对苏木精-伊红染色的患者样本进行评估，确定了两个感兴趣区域：主肿瘤区（Bulk）和邻近区域（Adjacent），后者主要由健康组织及弥散浸润的癌细胞组成。通过显色免疫组织化学方法，在每位患者的样本中均检测到星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞呈阳性染色。

我们未使用一抗进行染色，作为阴性对照。根据制造商建议，并经过进一步稀释后，最终确定抗ALDH1L1抗体以1:200的稀释比例使用，因其在细胞体和突起中显示出最佳的阳性染色效果，同时背景染色最小。使用Image J软件，对OSP-1阳性少突胶质细胞染色的覆盖百分比进行定量，以最终比较我们感兴趣区域之间的差异。

在对图像应用适当的阈值后，可测量并比较多位患者的阈值百分比覆盖面积。本研究比较了五例胶质母细胞瘤（GBM）患者样本中相邻区域和主体区域以及健康脑组织的少突胶质细胞特异性蛋白1（OSP1）的百分比覆盖面积。一旦掌握该染色技术，若操作得当，第一天可在四小时内完成，第二天则仅需两小时。

在进行该操作时，重要的是要密切监测组织染色强度和水合状态。