多重免疫荧光结合空间图像分析用于肿瘤微环境的临床与生物学评估

在我们的实验室中，我们正在研究人类结直肠癌、其向转移性疾病的进展过程以及其对包括免疫治疗在内的各种治疗手段的反应。我们通过研究原发性和转移性病变中的肿瘤免疫微环境及瘤内微生物组，试图寻找新的预测性和预后性生物标志物。在当前的项目中，我们正在应用多种技术，包括RNA测序、全外显子组测序、TCR测序、循环游离DNA分析、免疫荧光以及荧光原位杂交。

目前，我们的主要挑战是将荧光原位杂交染色与酪胺信号放大多重免疫荧光技术相结合，以研究微生物组与免疫细胞之间的相互作用。我们的方法具有稳健性、可重复性、易于使用且成本效益高。任何配备荧光切片扫描仪的实验室均可建立该方法；此外，与通常仅针对有限抗原组合优化的商业化试剂盒不同，该方法可与任何市售的免疫组化抗体联合使用。

进行多重免疫荧光染色前，先固定组织并进行脱蜡和内源性过氧化物酶抑制。随后进行多重免疫荧光染色时，将切片浸入含有10毫摩尔柠檬酸缓冲液（含0.1% Triton X-100）的300毫升染色缸中。将染色缸盖上盖子放入微波炉中，以最大功率加热3至5分钟，直至缓冲液开始沸腾。

煮沸后，将微波炉调至低功率加热15分钟，使缓冲液保持接近沸腾的温度。再次将微波炉调至最大功率，加热90秒。从微波炉中取出烧杯，让缓冲液在室温下冷却15分钟。

将载玻片用蒸馏水冲洗三次，每次五分钟，随后用含有0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBS Tween）冲洗五分钟。最后一次洗涤后，用纸巾轻压载玻片以吸除TBS Tween。接着，将载玻片放置于显微镜载玻片盒上，并用疏水笔在组织周围画圈。

用含5% BSA的TBS Tween溶液覆盖组织以封闭非特异性结合位点。30分钟后，将切片在纸巾上轻轻吸干以去除封闭液。随后，加入300 µL用1% BSA TBS Tween稀释的一抗溶液，室温孵育60分钟。

孵育后，用TBS Tween缓冲液将切片冲洗三次，每次三分钟。洗涤后，加入300 µL多聚-HRP二抗，孵育40分钟。孵育结束后，再次用TBS Tween缓冲液将切片冲洗三次，每次三分钟。

接下来，将组织与300微升荧光素酪胺试剂在硼酸盐缓冲液中孵育10分钟，该试剂需临时用含0.003%过氧化氢的硼酸盐缓冲液稀释200倍。然后用TBS Tween缓冲液洗涤切片三次，再将组织在4摄氏度下与人广谱细胞角蛋白抗体在含1% BSA的TBS Tween缓冲液中4℃过夜孵育。次日，用TBS Tween缓冲液冲洗组织，随后在含1% BSA的TBS Tween缓冲液中加入稀释200倍的荧光素标记二抗，孵育120分钟。

孵育后，用TBS Tween缓冲液冲洗组织，然后将组织在含10% BSA的TBS Tween缓冲液中加入稀释1000倍的双苯并咪唑染核5分钟。用蒸馏水冲洗组织三次，每次三分钟，随后使用荧光封片剂和硼硅酸盐盖玻片将组织封片。进行图像分析时，将扫描图像导入图像分析软件。

然后转到“分析”选项卡，通过点击“设置”、“操作”，然后选择“加载”，来选用高重荧光算法。在“染料选择”选项卡中，选择目标染料。在“核检测”选项卡中，进入“核分割类型”，选择“AI 自定义”。

然后在核分割分类器中，选择已保存的训练好的人工智能模型。在膜和细胞质检测选项卡中，选择最大的细胞质半径以及膜染料的数量。针对每种染料，选择细胞核阳性阈值、细胞质阳性阈值和膜阳性阈值。针对每种染料，选择细胞核、膜和细胞质的完整性百分比值。

通过选择“设置”、“操作”和“保存”来保存算法。通过点击“分析”并选择“标注层”来分析感兴趣区域。然后转到“结果”选项卡，选择“对象数据”中的所有数据。

通过右键单击“导出”并选择“对象数据 CSV”，以 CSV 格式导出数据。图中显示了多重免疫荧光染色的最佳结果示例。选择正确的稀释比例对于验证抗体特异性以及优化染色的信噪比至关重要。