对称与非对称溶液条件下带电囊泡相行为的荧光显微镜监测

本实验方案的总体目标是定量评估生理条件下高盐环境及跨膜溶液不对称性对膜相态的影响。细胞内和细胞外的溶液存在显著差异。我们的方法有助于理解溶液不对称性对膜特性及相行为的影响。

本方法的主要优势在于，可在生理缓冲条件下制备囊泡，并可利用微流控装置创建不对称的缓冲环境。开始操作前，先用细砂纸打磨聚四氟乙烯（PTFE）板的一侧。用商用洗洁精、乙醇和氯仿清洗该板材、一个15毫升玻璃小瓶以及一个可密封的玻璃容器。

使用25微升玻璃注射器将10至15微升溶于氯仿的脂质储备液滴加到洁净干燥的聚四氟乙烯（PTFE）板的粗糙面上。用注射器针头将脂质储备液铺展，形成均匀的脂质膜。使用镊子将板转移至15毫升小瓶中。

将平板在 60 摄氏度下加热，并干燥两小时以蒸发溶剂。然后，向玻璃容器中加入去离子水，水位高度约为一厘米。将装有平板的小瓶放入容器中，确保其保持稳定且直立，并密封容器。

将脂质双层在60摄氏度下预溶胀四小时。然后，将小瓶从容器中取出。用塑料注射器吸取五毫升溶胀溶液，并在注射器尖端安装一个0.45微米的过滤器。

将过滤后的溶胀溶液加入小瓶中，以水合脂质膜。盖紧小瓶，并用塑料石蜡膜密封。将小瓶于60 °C下孵育过夜，以获得GUV聚集体。

从加热环境中取出后一小时内将囊泡冷却至室温。剪去一个200微升塑料微量移液枪头的末端，以便将GUV聚集体吸入枪头中。用修剪过的枪头将聚集体及50微升溶胀溶液转移至一个洁净、干燥的2毫升小瓶中。

向小瓶中加入950微升新鲜溶胀溶液或等渗溶液，以分别获得对称或不对称的溶液条件。用移液器将混合液上下吹打，然后轻轻翻转小瓶数次，以重新悬浮GUVs。开始检测时，将一份GUV悬液置于载玻片的硅胶隔离腔内。

用盖玻片密封样品室。让样品重新平衡5分钟。然后将载玻片置于荧光显微镜的样品台上，每批至少采集30个GUVs的图像。

观察图像以确定GUVs的相态。处于单一液相状态的GUVs呈球形且表面光滑，荧光标记在膜中均匀分布。处于液相有序与无序两相状态的GUVs呈球形，荧光标记在膜内部分布成具有平滑边界的结构域。

验证这些结构域是否可在囊泡表面自由扩散并发生融合。处于两相或三相固-液相态的GUVs会呈现圆形，但具有一些角状边界。在固相背景上的液相结构域不应表现出扩散现象，而固相结构域则应在液相背景上自由扩散。

确定每张图像中GUV的相态后，判断该批次的主导相态。若主导相态仅占微弱多数，则需使用独立样品重复该过程。在使用微流控装置之前，需分别准备至少五毫升的蔗糖和盐类溶胀溶液。

将每种溶液通过0.45微米滤膜过滤。接着，剪去200微升塑料移液枪头的末端，并将移液枪头插入装置的每个通道中。向装置的储液池中加入100微升新鲜过滤的溶胀溶液，该溶液的类型应与制备GUVs时所用的相同。

向每个移液吸头中加入 5 µL 肿胀溶液。以 900 ×g 离心 10 分钟，使装置的通道充满溶液。然后，用同一过滤的肿胀溶液填充一支 1 mL 玻璃注射器。

将一段管路连接到注射器上。推动溶胀溶液通过管路，直至活塞完全压下，且管路内充满溶液。然后，将管路连接至出口通道，并将注射器安装在注射泵上。

接下来，将压力控制单元连接到微流控通道的入口。确保阀门处于关闭状态，然后将压力设定为三个巴（3 bar）。将微流控装置放置在倒置共聚焦显微镜的样品载物台上。

使用移液器从装置储液池中移除溶胀溶液，直至仅剩 25 至 50 微升溶液。向储液池中加入 150 微升 GUV 悬液，并用移液器轻轻吹打混合悬液。以 10 微升/分钟的速度运行注射泵的回抽模式，持续 20 分钟，或直至装置中超过 90% 的捕获位点被占据。

然后，打开压力控制单元的阀门，以关闭微流控装置中的环形阀门。停止注射泵，并让装置静置一小时，随后采集装置中GUVs的共聚焦图像。接下来，使用移液器从储液池中移除GUV悬液，仅保留25至50微升。

向储液池中加入150微升另一种过滤后的膨胀溶液，并用移液器轻轻吹打混合液5次以上，以彻底置换储液池中的溶液。将注射泵设置为回抽模式，以每分钟10微升的速度运行10分钟，以置换微通道中的溶液。

然后，将流速降低至每分钟1 µL。关闭压力控制单元的阀门2秒，随后打开阀门并停止注射泵。让装置静置1小时，然后记录共聚焦图像。

开始准备温度控制室时，首先将带凸缘的管接头连接到带有两毫米厚盖玻片窗口的铝制热流组件上。将橡胶垫片固定在其中一个盖玻片上，以形成观察室。向观察室内加入100微升GUV悬浮液，并用盖玻片密封观察室。

缓慢翻转装置组件。将铝制腔室连接至外部水浴。将组件安装在显微镜载物台上。

将外部水浴设置为最低目标温度，使系统平衡10至15分钟。采集GUVs的图像，并确定其在不同温度下的相态。GUVs由不同比例的DOPG、卵鞘磷脂和胆固醇在对称的蔗糖或盐溶液中制备而成。

通过荧光显微镜确定了它们的主要相态。随后，通过稀释将选定的组分转移至不对称条件下，以评估溶液条件对相行为的影响。为了进一步研究GUV在不对称溶液中的相行为，将GUV捕获在微流控装置中，以实现外部溶液的完全置换。

通过共聚焦显微镜在流体交换前后对捕获的GUVs进行评估。监测了一系列温度下均相GUVs与相分离GUVs的比例，以评估温度对GUVs相行为的影响。实验数据呈现出S形曲线，并据此拟合为Boltzmann模型。

从拟合曲线中确定相分离GUVs比例为0.5时的温度。尽管该方法可提供关于膜相行为的信息，但该技术也可应用于其他实验，例如在生理条件下研究生物分子间膜的相互作用。