利用视频显微镜评估人体脂肪组织微血管功能

该视频显微技术的总体目标是研究分离出的微血管在药物和生理刺激下的功能特性，从而深入了解导致人类血管功能障碍的病理生理学和分子机制。该方法有助于阐明与全身性疾病相关的脂肪组织内局部微血管功能障碍的分子机制。该技术的主要优势在于，血管在从人体取出后的一段时间内仍能保持其功能活性，并可方便地用于检测其生理特性。

该实验方法的临床意义在于，它能够帮助我们识别在疾病状态下发生差异性改变的通路，并有可能发现新的治疗靶点。在组织解剖显微镜下，使用显微剪刀和显微镊子仔细去除脂肪样本中小动脉周围的脂肪和结缔组织。必须将小动脉与小静脉区分开来。

动脉通常比微静脉直径更小，张力更强，且反应更为显著。动脉分离后，使用尼龙或丝线结扎所有分支。接着，用10毫升注射器缓慢将管道填充新鲜的Krebs溶液。

然后，将橡胶管连接到压力储液器和腔室内的玻璃毛细移液管上。接着，将分离好的动脉移至器官浴槽，并将其套在玻璃毛细移液管上进行插管。用尼龙缝合线仔细固定动脉两端于移液管上。

固定血管后，缓慢将腔内的克雷布斯缓冲液移除，并向腔内加入 2 mL 新鲜的克雷布斯溶液。接着，将器官腔室安装到配备摄像机的倒置显微镜载物台上。以每秒一千赫兹的采样率启动边缘检测软件。

将剩余的加压管路连接到第二个装有Krebs溶液的压力储液罐，然后将压力储液罐与压力传感器连接。当所有管路连接完毕后，将加热块设置为37摄氏度。接着，使用压力控制装置每5分钟逐步增加5毫米汞柱的管腔内压力，以达到离体血管管腔内所需的实验压力。

当压力达到60毫米汞柱时，使血管平衡20至30分钟，并记录脂肪动脉在静息状态下的直径。在平衡期结束时，通过每隔5分钟向浴液中直接加入1微升内皮素-1，直至血管直径收缩至静息基线直径的约55%，实现对血管的预先收缩。对于血流诱导的内皮依赖性血管舒张，向动脉管腔内以相等且相反的方向施加持续流动，从而在不改变管腔内平均压力（60毫米汞柱）的情况下，在血管两端形成压力差。

三到五分钟之后，测量血流介导的血管扩张。每五到六分钟增加一次压力梯度，每次增加10厘米水柱，直至最大值达到100厘米水柱。在评估完血流介导的血管扩张后，将压力储液器调回相同高度，以停止血流的诱导。

然后立即但小心地将灌流液更换为新鲜的Krebs溶液，注意不要扰动悬浮的动脉，并让血管在20至30分钟内逐渐恢复至基础直径。一旦动脉恢复至静息状态的基础直径，即可评估微弱的胆碱介导的内皮依赖性血管舒张反应。该过程首先通过内皮素1将血管预收缩至其静息直径的大约55%，具体操作如前所述。

达到预收缩状态后，将逐渐增加剂量的乙酰胆碱直接加入浴槽中，每次加入两微升。每次给药后五分钟记录动脉直径的变化。完成乙酰胆碱剂量反应实验后，通过依次向浴槽中直接加入罂粟碱和非内皮依赖性血管扩张剂，评估非内皮依赖性血管舒张功能及血管活性。

在人类肥胖状态下，内脏脂肪动脉对血流增加和剪切应力或乙酰胆碱刺激所引起的内皮依赖性血管舒张反应，显著弱于皮下脂肪动脉。然而，对罂粟碱引起的非内皮依赖性血管舒张反应在这两种脂肪组织间并无显著差异，表明内脏区域的血管功能障碍在很大程度上是由于内皮水平的功能异常所致，至少在疾病早期阶段如此。若操作熟练，该技术可在三至五小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要记住保持耐心并认真细致，因为即使对血管造成轻微损伤，也可能影响实验结果。完成该操作后，还可进一步开展其他方法，例如对血管进行siRNA转染，以探究特定基因在人类疾病中对血管舒缩功能的影响。该技术建立后，为脂肪组织生物学和微循环领域的研究人员探索肥胖状态下脂肪组织微环境对局部血管健康的影响开辟了道路。

观看本视频后，您应能充分理解如何直接检测从活体受试者体内取出的人体血管完整节段的病理生理学特性，这一过程是无创成像技术无法复制的。