利用整体染色法观察三维白色脂肪组织结构

该方法有助于解答脂肪生物学领域中的关键问题，例如在禁食和肥胖等不同代谢条件下，细胞间相互作用和脂肪组织生理学如何发生变化。该技术的主要优势在于能够最大限度地保持脂肪组织原有的三维结构，并避免常规免疫组织化学所必需的繁琐处理步骤。尽管该方法可用于研究脂肪组织的结构，但也可通过整体染色脑组织的方式，将其应用于其他器官系统，如神经系统。

通常，初次使用该方法的研究人员会面临一些困难，例如难以获取合适的组织样本、确定适当的固定时间以及优化抗体浓度。解剖完成后，将盛有组织样本并含1%多聚甲醛的培养皿从冰上转移至室温，放置一小时。随后将组织转移至12孔或24孔细胞培养板中，以便更快地进行洗涤。

需要注意的是，整体染色实验必须在解剖后立即开始，且各步骤之间没有可暂停的节点。将组织置于含0.3%吐温的磷酸盐缓冲液（PBS-0.3T）中，在22度倾斜的摇床上以每分钟20至25次的频率于室温下振荡洗涤5分钟。重复此洗涤步骤额外两次。

此后，加入约 0.5 至 1 毫升含 5% 动物血清的封闭缓冲液。将酶标板置于摇床，在先前相同的条件下孵育 1 小时。吸去封闭液，每孔加入 1 毫升用含 1% 动物血清的 PBS-0.3T 稀释的一抗溶液。

将培养板置于4°C、22度倾斜、每分钟20至25次摇动的摇床中孵育过夜。次日，使用PBS-0.3T在室温下洗涤组织5分钟。重复此洗涤步骤两次。

然后，向每个孔中加入0.5至1毫升适当稀释的二抗溶液。用铝箔纸包裹板子，在室温下于摇床上孵育一小时。之后，用PBS-0.3T在室温下洗涤板子两次，每次洗涤五分钟。

如果在中性脂质染色过程中需要观察液体液滴，请用1×PBS洗涤两次，每次洗涤持续五分钟。加入用PBS稀释的中性脂质染料，并在室温下孵育30分钟。开始成像时，使用镊子将组织平整地放置在24 × 60毫米的玻璃盖玻片上。

如果需要使用 DAPI 进行细胞核染色，可加入一到两滴含有 DAPI 的封片剂，完全浸没组织以防止其干燥。然后将载玻片置于倒置共聚焦激光显微镜系统上。为获得全-mount 染色组织在多个焦平面的图像，应在所需放大倍数下进行深度为 100 至 150 微米、步长为 4 至 6 微米的 Z 轴层扫成像。

本研究采用整体染色法以保存脂肪组织的结构。与涉及多个处理步骤和切片过程、可能导致脂肪组织形态变形的方法不同，整体染色法能够保持脂肪细胞的形态完整性，从而在结果解读时确保准确性。脂肪组织过度固定会导致固定剂诱导的自发荧光，可通过相同区域信号重叠现象加以识别，例如本图中可见的酪氨酸羟化酶与PECAM-1信号重叠。

然而，经过适当固定的全组织染色样品显示出独立且清晰的信号，表明这些信号并非自发荧光。对全组织染色的脂肪组织进行成像，可实现不同实验条件下形态学变化的定量分析。特别是脂肪组织具有高度血管化特征，这在能量水平快速变化时维持代谢稳态过程中起着重要作用。

例如，经过24小时禁食的C57黑6J小鼠表现出显著更小的脂肪细胞体积，表明发生了脂解作用，且与持续喂养的小鼠相比，其血管密度呈上升趋势。使用iDISCO+对脂肪组织进行透明化处理，可使其变为光学透明。对经过组织透明化处理的脂肪组织进行免疫标记显示，在相同放大倍数下，其神经分支密度明显高于未经透明化处理而直接进行整体染色的样本。

在进行该操作时，需注意避免在室温下使用PFA对样品过度固定超过一小时，否则会增加背景自发荧光。然而，若在4摄氏度条件下进行固定，则可适当延长固定时间。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如使用ImageJ进行定量分析）来回答更多科学问题，例如细胞结构（如脂肪细胞区域和血管密度）如何响应不同的生理条件而发生变化。