使用 A-seq2 进行 3' 端测序文库构建

该方法的总体目标是捕获并测序 mRNA 的 3' 末端，从而能够研究 mRNA 的加工过程，特别是 3' 末端的切割与多聚腺苷酸化，以及基因表达水平的定量分析。本文所介绍的 A-seq2 实验方案及数据分析软件包，有助于解答关于不同细胞类型和组织中转录本异构体生成与功能的关键问题。A-seq2 方法的主要优势在于，它避免了对长段多聚(A)序列的测序，并且不会产生接头二聚体。

使用生长至80%汇合度的细胞进行此操作。移除培养基，并用PBS洗涤细胞一次。通过每孔加入一毫升裂解缓冲液，并使用橡胶刮刀将细胞材料从培养板表面完全刮下，直接在培养板上裂解细胞。

使用1 mL移液枪头将每孔中的黏稠裂解液转移至15 mL塑料管中。用连接23号皮下注射针头的1 mL注射器反复抽吸裂解液，快速上下推动活塞数次，直至裂解液不再黏稠。

将裂解液转移至1.5毫升离心管中，在4°C条件下以20,000 × g离心5分钟，以去除碎片。收集裂解液的澄清上清。

加入寡聚脱氧胸苷酸[d(T)25]磁珠并重悬混合物。将离心管置于旋转仪上孵育10分钟。随后，将离心管置于磁力架上静置2分钟。

弃去上清液。向每管中加入 0.8 毫升缓冲液 A，将管子旋转 180 度两到三次。从第二次洗涤中弃去缓冲液 A。

向每根试管中加入 0.8 毫升缓冲液 B，并在试管架上静置 2 分钟。为从磁珠上洗脱结合的 mRNA，需移除缓冲液 B，向每根试管中加入 33 微升水，并重悬磁珠。将样品置于预热的金属块中，在 75 摄氏度下加热 5 分钟。

立即以离心机离心1秒，然后将离心管置于磁力架上。将上清液转移至新的离心管中。向每根离心管中加入66 µL碱性裂解缓冲液，混匀后在加热块上95 °C准确加热5分钟。

立即将离心管置于冰上冷却。随后按照文本方案中所述，使用RNA纯化试剂盒进行RNA提取。开始此操作时，向每个RNA样品中加入14微升多聚核苷酸激酶主混合液。

在37摄氏度下孵育30分钟。30分钟后，将激酶反应液上样至预先准备好的离心柱中。以735 × g离心2分钟。

弃去柱子，将收集到反应产物的离心管置于冰上。为了阻断RNA片段的3'末端，防止其在后续连接反应中发生串联，向每个样品中加入17.5 µL的多聚(A)聚合酶主混合液。混匀后瞬时离心1秒。

在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。30 分钟后，向每个反应体系中加入 32.5 微升水，并按照文本方案中的描述纯化 RNA。开始此操作时，先将反应物置于真空浓缩仪中 10 分钟，使体积减少至 6 微升。

然后向每个反应体系中加入24微升RNA连接酶主混合液。将反应体系置于加热振荡器中，在24摄氏度下孵育16小时，期间以每分钟1000转的速度间歇性振荡。次日，向每个反应体系中加入17微升水并混匀。

按照文本方案所述纯化RNA。将洗脱液置于真空浓缩仪中浓缩3分钟，使体积减少至11微升。将反应体系转移至200微升PCR管中，用于逆转录反应。

加入1 µL引物。在PCR仪中70 °C加热5分钟，然后在室温下放置5分钟。向每个试管中加入8 µL反转录主混合液，并混匀。

将试管放入PCR仪中。先在55 °C下加热10分钟，再在80 °C下加热10分钟。随后置于冰上保存。

按照文本方案所述制备链霉亲和素磁珠。将反转录反应产物加入磁珠溶液中，在4°C条件下于旋转仪上孵育20分钟。使用磁力架，先后用生物素结合缓冲液洗涤磁珠两次，再用TEN缓冲液洗涤两次。

将珠子重悬于50 µL TEN缓冲液中。加入2 µL尿嘧啶DNA糖基化酶酶混合物，在37°C下于摇床中孵育1小时，期间进行间歇性混匀。向每个反应体系中加入50 µL水、11 µL RNase H缓冲液和1 µL RNase H。

在37摄氏度下孵育20分钟。将试管置于磁力架上，转移含有切割后cDNA的液体至新试管中。按照文本方案中的描述，使用PCR纯化试剂盒纯化切割后的cDNA。

将纯化的 cDNA 置于真空浓缩仪中浓缩八分钟，浓缩至七微升体积。为了将5'接头连接到分离的 cDNA 的5'末端，向每个样品中加入23微升RNA连接酶主混合液，并在24摄氏度下孵育20小时。最后，向每个反应体系中加入70微升水。

进行一次小规模PCR反应，以确定在指数扩增阶段达到文库扩增的最佳PCR循环次数。将以下组分加入一个200微升的PCR管中：25微升DNA聚合酶混合液、20微升连接反应产物、2微升水、1.5微升正向PCR引物和1.5微升反向PCR索引引物。运行如下程序的PCR仪：95摄氏度3分钟，随后进行20个循环，每个循环包括98摄氏度20秒、67摄氏度20秒和72摄氏度30秒。

在指定循环结束后，直接从扩增仪中收集七微升等分试样。使用2%琼脂糖凝胶分离产物，并观察PCR产物的迁移情况。确定指数扩增初期的循环数（本示例中为12个循环），并采用该循环数进行大规模PCR反应。

将大规模PCR反应的产物在2%琼脂糖凝胶上进行分离，并切下含有200至350个核苷酸DNA产物的凝胶片段。随后，按照文本方案所述，使用凝胶回收试剂盒从凝胶片段中提取DNA。本视频仅展示最重要的计算步骤。

更多详细信息请参见文本方案。首先克隆 Git 仓库并进入新创建的目录。创建一个包含所需软件的环境，并激活该环境。

下载获取 A-seq2 数据的生物体的基因组序列。打开配置文件，并按照文字版实验方案中的说明设置输入参数。启动分析。

通过分析来自两份HEK-293细胞样本的a-seq2测序读段，研究了特定基因NUP214在HNRNPC蛋白敲低条件下的响应情况；这两份样本分别用对照小干扰RNA或HNRNPC小干扰RNA进行处理。由分析流程注释的记录多聚腺苷酸化位点（poly(A) sites）的测序读段以BAM格式保存，并作为输入数据导入IGD基因组浏览器。读段峰的3'端映射至Ensembl数据库中注释的mRNA 3'端位置。

这些图谱表明，在HNRNCR敲低后，长的3'非翻译区异构体的使用增加。一旦掌握，A-seq实验方案需要八小时的动手操作时间，或大约两到三天，不包括细胞培养和过夜连接的时间。在实施该方案时，首先设计一组符合本地测序平台要求的引物至关重要。

获得mMRA的3'末端后，可进一步采用交联免疫沉淀等方法，鉴定pre-mRNA 3'末端加工的调控因子。A-seq2为RNA加工领域的研究人员探索选择性多聚腺苷酸化在特定细胞类型中的调控机制及其生物学效应奠定了基础。观看本视频后，您应能够熟练掌握mRNA 3'末端文库的构建方法、测序数据的分析流程、新多聚腺苷酸化位点的鉴定以及使用频率的定量分析。

我们希望 A-seq2 能够简化您在 mRNA 加工调控研究中的工作，并带来许多新的见解。