利用细菌接合在肠杆菌科菌株（如Escherichia coli或Shigella flexneri）中构建高密度转座子插入文库

本实验方案的总体目标是利用细菌接合技术，在大肠杆菌（Escherichia coli）或福氏志贺菌（Shigella flexneri）中构建高密度转座子插入文库。该技术可通过Tn10转座子在基因组中的随机插入，产生数十万个独特的细菌突变体。该方法的主要优势在于，携带转座子的质粒通过细菌接合方式进行转移，相较于电穿孔等效率较低的方法更为高效。

此外，Tn10 转座子本身插入基因组的偏好性低于其他转座子。采用无菌操作技术，将一毫升供体菌株的过夜培养物加入无菌的微量离心管中。该管应进行标记，例如用 D 表示供体。

对受体菌株进行同样操作，取一毫升受体菌株的过夜培养物至无菌离心管中。例如，可标记为 R，代表受体。将两个离心管在室温下以 14,000 ×g 离心一分钟。

此步骤可在台式离心机中进行。离心机运行期间，准备用于偶联的滤膜。使用无菌镊子将硝酸纤维素滤膜放置于不含抗生素的、已标记的LB琼脂平板上。

或者，可使用无菌印迹纸代替硝酸纤维素滤膜。将每张滤膜分别置于不同的LB琼脂平板上，以尽量减少污染。确保每张滤膜都放置在已正确标记的LB琼脂平板上。

制备三个含有滤膜的平板，分别用于供体菌株、受体菌株和文库。离心结束后，取出过夜培养物。

移除离心管中所有含抗生素的培养基并弃去。注意不要破坏或扰动细菌沉淀，但应尽量去除全部培养基。操作过程中须保持无菌，并在处理每个样品之间更换吸头。

向每个离心管中加入 110 微升不含抗生素的新鲜 LB 培养基，上下吹打以重悬菌体。操作过程中须保持无菌。通过反复吹打数次，确保无细胞团块残留。

此步骤旨在浓缩细菌培养物，并去除过夜培养中残留的任何抗生素。使用移液器将50 µL浓缩后的供体菌液转移至标记为“Donor”的滤膜上。以逐滴方式缓慢将50 µL菌液加入滤膜。

对受体菌株进行相同操作，将50微升重悬的菌液逐滴加入到受体滤膜上。为了使接合反应发生，需将受体菌株和供体菌株同时加至同一张滤纸上，以确保二者有密切的物理接触。为此，请将50微升供体菌株和50微升受体菌株同时加至标记为“文库”（library）的培养皿中的同一张滤纸上。

将含有滤膜的琼脂平板置于37摄氏度下孵育六小时。接合过程在37摄氏度下持续六小时。在接合期间，pJA1质粒进入受体菌株。

接合后，通过涡旋使细菌从滤膜上解离，并加入1毫摩尔IPTG进行诱导。IPTG可诱导转座酶表达，携带卡那霉素抗性基因的转座子将随机插入受体菌株的基因组中。将细菌涂布于含有卡那霉素及另一种抗生素的LB琼脂平板上，以筛选含有转座子的受体菌株。

受体菌株为 Lambda pir 阴性，因此 pJA1 质粒会丢失。在 37°C 下培养六小时后，接合完成。从培养箱中取出含有滤膜的培养皿。

使用无菌镊子从 LB 琼脂平板上取出含有阴性供体对照的滤膜。轻弹试管，使滤纸沉至锥形小瓶底部，并确保滤膜完全浸没于 LB 培养基中。该试管中含有 2 mL 添加了 IPTG 的 LB 培养基，IPTG 的终浓度为 1 毫摩尔/升。

将试管涡旋震荡一分钟，使细菌从硝酸纤维素滤膜上解离下来。LB培养基应变得浑浊，表明含有细菌细胞。对受体对照组和文库组同样重复此步骤。

在将含有细菌细胞的滤膜充分涡旋振荡以使细菌从滤膜上充分解离后，将细菌细胞接种至选择性培养基上。在此步骤中，将细菌接种到含有卡那霉素以及另一种抗生素（如萘啶酸）的LB琼脂平板上。使用卡那霉素是为了筛选出转座子已成功整合至基因组并携带卡那霉素抗性标记的受体细胞。

通过筛选去除基因组中未整合标记的受体细胞。使用另一种抗生素（如萘啶酸）来筛选去除供体菌株。此处使用的供体菌株对萘啶酸敏感，而受体菌株则对萘啶酸具有抗性。

使用这种第二种抗生素，可以去除供体菌株。在此步骤中，应涂布多个稀释梯度，以确定能够产生大量且分布适当的菌落的文库稀释度。在计数并记录所有含有转座子文库的平板上的菌落数量后，部分使用者可能希望将文库汇集或合并到一个离心管中。

可使用无菌涂布棒进行操作。向含有转座子文库的LB琼脂平板中加入1毫升LB培养基。待培养基加入平板后，用无菌涂布棒刮下并分散平板上的细菌。

通常无法将平板上的所有细菌完全移除。将细菌悬液转移至 50 ml 或 15 ml 的锥形离心管中。对所有平板重复此操作。

所有平板刮取完成后，将汇集的细菌悬液涡旋振荡整整一分钟，以打散任何细胞团块。此时即得到汇集的文库。在37°C下培养18小时后，供体和受体对照平板上应无任何菌落生长。

含有突变体文库的平板理想情况下应包含大量大小各异的菌落。不同大小的菌落表明克隆具有不同的适应性，这是实验方案成功的一个良好迹象。构建高密度的细菌转座子突变文库可能对多种下游应用具有优势，范围从毒力基因和细菌病原体的发现、必需基因的研究，到遗传相互作用网络的鉴定。

所有这些下游应用都依赖于构建一个密集的转座子插入文库。本文介绍的方法提供了一种简单、快速且经济的流程，用于在大肠杆菌或福氏志贺氏菌等肠杆菌菌株中构建高密度的转座子文库。