用于细菌接合转移蛋白序列特异性分析的接合交配实验

本交配实验的总体目标是评估接合转移基因内的突变对其在功能性Ⅳ型分泌复合物背景下影响质粒转移能力的作用。该方法可用于提出针对特定蛋白质的科学问题，例如鉴定在接合过程中转移蛋白组装功能性Ⅳ型分泌系统时，蛋白间相互作用发生的区域。在本技术中，通过同源重组敲除大型接合质粒上的基因。

通过将目标基因搭载在较小的质粒上提供给基因敲除个体，从而评估基因功能。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为实验的组织与准备工作是成功实施该操作的关键。必须进行恰当的实验准备，才能获得可解读的结果。

按照文本方案中的描述，开始本实验前首先准备经消化的 pBAD33 质粒。将每种酶切产物在琼脂糖凝胶上进行电泳。使用紫外透射仪和无菌剃刀，从凝胶中切下对应于 cath 序列的 2.8 千碱基条带。

操作需迅速，以尽量减少 DNA 的紫外线暴露。使用凝胶回收试剂盒，按照制造商的说明书从切下的凝胶条带中提取 DNA。通过聚合酶链式反应（PCR）扩增提取的 cat 筛选标记片段。

在无菌的PCR管中配制反应混合物。使用含有与目标基因序列同源的末端序列的引物，以用于同源重组。设置一个阴性对照，其成分与反应体系相同，但将模板DNA替换为双蒸水。

同时，使用已证实可在PCR反应中有效扩增的模板DNA和引物建立阳性对照。通过移液操作轻轻混匀所有反应组分。然后，根据文本方案中列出的PCR参数扩增提取的cat基因片段。

仅使用每种反应产物5 µL，通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段大小正确。使用PCR纯化试剂盒，按照制造商提供的方案纯化PCR扩增产物。将300 纳克扩增后的cat基因盒加入到50 µL含有pOX38-Tc质粒的冰上放置的电转化感受态DY330R细胞中。

轻轻吹打混匀。使用未修饰的 pBAD33 质粒作为阳性对照重复此步骤。然后，将细胞转移至预冷的 1 毫米电穿孔杯中。

使用电穿孔仪，在1.8千伏电压下对细胞进行电穿孔，时间常数为5.5毫秒。脉冲结束后立即用1毫升SOC培养基稀释细胞，并转移至新的微量离心管中。将细胞在32摄氏度下孵育2小时。

接下来，取100微升每种样品，分别接种到含有10微克/毫升四环素和20微克/毫升氯霉素的琼脂平板上。使用无菌涂布棒将样品均匀涂布于平板表面。将平板倒置于32摄氏度培养过夜。

第二天，筛选成功的重组子。导入细胞的cat基因盒将与目的基因发生同源重组，从而构建pOX38-Tc氯霉素敲除克隆。将300纳克pK184基因或pK184基因突变型质粒分别加入到50微升含有pOX38-Tc氯霉素敲除质粒的电转感受态DY330R细胞中，操作方法同前。

为获得XK1200供体细胞，需先进行接合交配，随后进行电穿孔，以获得同时携带氯霉素敲除片段和PK184质粒的XK1200细胞，具体操作如文本方案所述。用20毫升含氯霉素和卡那霉素的无菌LB培养基制备XK1200供体细胞的过夜培养物。同时，使用甘油保存菌种或琼脂平板上的单菌落，接种于50毫升含50微克/毫升链霉素的LB培养基中，制备MC4100受体细胞。

将培养物在37摄氏度、200 rpm振荡条件下培养。向所有供体细胞中加入葡萄糖，使其终浓度为100毫摩尔。次日，将每种过夜培养物分别用含有相同抗生素的2毫升无菌LB培养基按1:70比例稀释。

在37摄氏度、200 rpm振荡条件下将细胞培养至对数中期。离心菌液以沉淀细胞，并弃去上清液。随后用预冷的无菌LB培养基洗涤菌体沉淀一次，以去除抗生素。

按照之前的方法再次离心后，将细胞重悬于2毫升冷的无菌LB培养基中。取100微升供体细胞和100微升受体细胞，分别加入800微升无菌LB培养基中（总体积为1毫升），每个处理设两个重复。将细胞在37摄氏度下孵育1小时，期间不振荡，以允许细胞接合。孵育1小时后，涡旋振荡细胞30秒，以破坏接合对。

然后，将细胞置于冰上10分钟，以防止进一步接合。使用对数中期培养物和新鲜无菌的LB培养基，将供体和受体细胞分别从1:100至1:1000万进行六倍系列稀释。在含有萘啶酸、氯霉素和卡那霉素的琼脂平板的两个半区上，分别点样10微升各稀释度的XK1200供体细胞。

将受体MC4100细胞的不同稀释液重复点样于含有链霉素的琼脂平板上，然后在37摄氏度下过夜培养。接着，使用涡旋振荡混合物和新鲜无菌LB培养基，制备六种不同稀释度的接合子。

通过将每个稀释度的十微升等分试样点样到含有链霉素和氯霉素的琼脂平板的每一半，筛选含有 pOX38-Tc 氯霉素敲除质粒的转接合子 MC4100 细胞。对两份重复混合物均进行重复操作。然后，在 37 摄氏度下将平板过夜培养。

通过计数各供体、受体及接合子细胞在相应平板上相同稀释度点样所形成的菌落数量，计算交配效率。同时，计数受体菌落，以检测在该稀释度下接合子数量多于受体时可能产生的偏差。将接合子菌落数除以供体菌落数，再乘以100，计算每100个供体细胞的交配效率值。

当将 pOX38-Tc 质粒中的 IV 型分泌系统基因 traF 敲除后，会导致 pOX38-Tc traF 氯霉素抗性敲除质粒从供体细胞向受体细胞的接合转移能力丧失。然而，当在供体细胞中通过 PK184 traF 质粒以反式提供 traF 基因时，可观察到 pOX38-Tc traF 氯霉素抗性敲除质粒的接合转移能力恢复。当供体细胞中含有 traF 基因的不同稀释突变体以及 PK184 质粒时，可观察到 pOX38-Tc traF 氯霉素抗性敲除质粒的接合转移能力丧失。

接合转移能力的丧失表明了该蛋白在接合型 IV 分泌系统内参与蛋白-蛋白相互作用的关键区域。随后可通过影响转移效率的点突变对该区域进行更深入的研究。一旦掌握，该技术可在一个工作日内完成，并包含预期的培养时间。

本方案可用于本文所展示之外的其他细胞。目前关键的一点是，供体细胞和受体细胞均不携带目标质粒。这样在加入敲除质粒后，不会产生干扰性结果。

在进行该实验操作时，必须保持高度的条理性，因为供体细胞、受体细胞和接合子细胞具有不同的培养条件和抗生素需求。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如晶体学、核磁共振（NMR）或质谱分析，以获得目标蛋白的详细结构与功能信息。