用于实时细胞分析仪的阵列式金微电极的再生

本实验的总体目标是再生用于实时细胞分析仪（RTCA）的商用电子板。该方法有助于解决一次性金基芯片再生领域中的关键问题，包括RTCA中所用电子板的再生。该技术的主要优势在于，再生过程可使用温和、易得且低毒性的实验室试剂完成。

我们最初在使用基于金芯片的实时细胞分析仪时萌生了该方法的想法。按照文本方案所述，在细胞培养皿中孵育并增殖A549细胞，以此开始本实验操作。向电子检测板L8的每个孵育孔中加入150微升细胞培养基。将该检测板置于生物安全罩内平衡30分钟。

30 分钟后，手动将电子板 L8 插入 CO2 培养箱中 37 摄氏度的实时细胞分析仪内。接着，在计算机上启动实时细胞分析仪操作程序。在默认的实验模式设置页面，选择实验模型，并为正在运行的检测命名。

在其布局页面中，选择实验所包含的相应孔位，并在编辑框中输入细胞类型、数量和药物名称等信息。在其时间表页面中，添加实验步骤，然后选择每一步的运行时间以及实时数据采集的间隔时间。点击开始以测量培养基的背景阻抗。

实验文件将被保存。所得数据将自动进行减法处理。在绘图页面中添加孔位后，将显示时间-细胞指数的曲线图。

进行细胞增殖实验时，首先单击暂停按钮以暂停程序。然后取出电子板，在室温下每孔加入100 µL A549细胞悬浮缓冲液。将该板置于生物安全罩内静置30分钟，使细胞沉降至培养孔底部。

手动将电子板插入实时细胞分析仪工作站中，然后点击开始按钮以继续实验。在绘图页面上，分析仪会在整个实验过程中持续记录细胞指数值或曲线。

实验完成后，进入绘图页面并打开实验文件。然后选择所有经过检测的培养孔以及最终的细胞指数曲线，在添加药物或更换培养基前最后一次进行平均或归一化处理，以减少不同实验之间的差异。在数据分析页面，可计算 EC50 或 IC50 值。

按照文本方案完成抗癌药物的细胞毒性评价后，从实时细胞分析仪工作站中取出含有细胞的电子培养板。将使用过的电子培养板置于室温下的无菌生物安全柜中，用移液器充分混匀培养基，然后用移液器吸除全部培养基。

在室温下，用 200 微升去离子水冲洗电子板三次。在 37 摄氏度的培养箱中，用 0.25% 新鲜配制的胰蛋白酶消化电子板上残留的细胞，持续一至两小时。消化完成后，在室温下的生物安全罩中，用移液器将培养液吹打混匀 5 至 10 次，然后移除溶液。

用 200 微升去离子水冲洗电子板两次。然后用 200 微升 100% 乙醇洗涤两次，接着用相同体积的 75% 乙醇洗涤两次。最后再用 200 微升去离子水冲洗两次。

将电子芯片倒置在无菌纱布或滤纸上，于室温下沥干残留水分。随后将再生后的电子芯片置于生物安全柜中，于室温下进行紫外线灭菌处理1至2小时。在使用芯片通过介孔材料进行药物递送（如文本方案所述）后，用胰蛋白酶消化残留细胞，操作方法同前。

由于移液器在实验中经常使用，操作人员需注意避免划伤移液头和微芯片表面。在室温下的生物安全柜中，用200微升去离子水冲洗微芯片一次。然后在室温下，用200微升无水乙醇冲洗微芯片两次。

接下来，在室温下用 200 微升 75% 乙醇冲洗微芯片一次。在每个孔中加入 250 微升 75% 乙醇，并在室温下用封板膜密封电子板。以 114 ×g 的转速离心电子板两分钟，然后弃去液体。

将电子芯片倒置在无菌纱布或纸巾上，于室温下倾倒出残留液体。重复用75%乙醇洗涤并离心。随后在生物安全柜中，于室温下对再生的电子芯片进行1至2小时的紫外灭菌。

通过拆卸孵育孔的底部（如文本方案所述），评估再生电子板表面的光学特性。为了评估A549细胞在新鲜和再生电子板上摄取抗癌药物后贴壁细胞的存活能力，使用共聚焦激光扫描显微镜监测细胞吸收的阿霉素（DOX）分子的自发荧光。记录细胞吸收的DOX自发荧光时，采用63倍油镜，并以485纳米作为激发波长。

接下来，通过以下步骤评估再生电极的电化学行为：首先使用抛光布上的抛光液将金电极和玻碳电极抛光至镜面状态。然后将电极在水中进行超声处理，以去除任何颗粒物。接着，在0.5摩尔的硫酸溶液中活化金电极。

在含有1毫摩尔铁氰化钾的10毫摩尔氯化钾电解液中，获取裸金电极和玻碳电极的电化学阻抗谱（EIS）数据。随后，将10微升细胞悬液滴加到GCE中的金电极表面。加入细胞后，将金电极置于GCE中，在37°C培养箱中孵育3小时，然后按照文本方案所述，获取经细胞修饰电极的EIS数据。

为了再生电极，将金电极浸入经细胞修饰的GCE中，并加入0.25%胰蛋白酶处理0.5至2小时。用纯水轻轻冲洗两个电极各四次，然后用无水乙醇轻轻冲洗电极各四次。

接下来，将金电极浸入75%乙醇中的GCE中约五分钟。五分钟后，用75%乙醇轻轻冲洗芯片四次，然后按照文本方案获取再生电极的EIS数据。为评估阵列金电子板的再生效率，对新鲜和处理过的电子板均进行了显微观察。

在微芯片表面的光学特性方面未发现明显的差异。利用阿霉素分子的荧光来评估细胞在金质微芯片再生前后细胞的状态。相似的均一性及清晰的细胞形态表明芯片具有可重复使用性。

再生方案用于细胞增殖的实际检测。从测试用电子芯片的多个培养孔中获得的生长曲线显示出良好的一致性，表明商用芯片成功实现了再生。此处展示的是，再生后的电子芯片L8被用于介孔二氧化硅材料的细胞毒性评估。

与对照组相比，介孔材料处理样品的细胞指数下降，表明该材料具有轻微的细胞毒性。介孔材料对抗癌药物阿霉素的进一步包封和释放，导致A549细胞生长曲线显著下降。一旦掌握，该技术若操作得当，可在四小时内完成。

在进行该操作时，需要注意的是，不同芯片之间的台式水槽消化时间可能存在差异。完成该步骤后，可采用其他方法，如共聚焦激光扫描显微镜，甚至光谱学、电化学阻抗谱等，以回答更多问题，例如评估再生效应。