一步法荧光显微镜评估辐射诱导克隆性细胞死亡模式的实验方案

本实验的总体目标是基于DAPI染色后细胞核的特征性形态，评估电离辐射诱导的克隆源性细胞死亡的主要模式。该方法有助于解答辐射生物学领域中的关键问题。这种快速且经济高效的技术主要优势在于，可同时评估电离辐射所诱导的克隆源性细胞死亡的各种主要模式。

通常，刚接触辐射生物学的研究人员会难以评估辐射诱导的克隆性细胞死亡，因为需要采用不同的检测方法来分别评价每种细胞死亡方式。我们最初是在使用多种细胞系和不同辐射剂量进行辐射诱导克隆性细胞死亡的大规模筛选时，提出了该方法的构想。尽管该方法可为辐射生物学研究提供重要信息，但也同样适用于其他系统，例如癌症的化学治疗。

演示该操作的是我们的合作者 Atsushi Shibata。首先，用经70%乙醇润湿的纸巾对解剖刀进行灭菌。然后使用解剖刀将盖玻片放入35毫米的细胞培养皿中。

向含有盖玻片的培养皿中加入一毫升培养基。现在用无菌镊子轻轻夹住盖玻片中央，彻底吸除培养皿中的培养基。接下来，在15毫升离心管中用培养基制备三毫升细胞悬液。

将细胞悬液加入培养皿中，在37摄氏度、5% CO2条件下培养过夜。通过倒置相差显微镜观察，确保细胞已贴附在盖玻片上且存活。

现在用6 Gy的X射线照射培养皿。照射后，将细胞置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育72小时。随后从培养箱中取出细胞，吸去培养皿中的培养基。

使用剪刀从1,000微升微量移液器吸头末端约五毫米处剪去尖端。用其向培养皿中加入一毫升固定液。沿培养皿壁加入固定液，以尽量减少对细胞的损伤。

然后将此培养皿转移至方形培养皿中，轻轻摇晃，使固定液均匀覆盖盖玻片。随后在室温下孵育10分钟。从培养皿中吸除固定液。

现在沿培养皿壁加入两毫升 PBS，然后吸去 PBS。为准备 DAPI 染色，将五微升 DAPI 染色试剂加到玻片上。

然后用解剖刀从培养皿中移除盖玻片，并用纸巾轻触盖玻片边缘以吸去多余的 PBS。现在将盖玻片细胞面朝下倒置在载玻片上的 DAPI 染色试剂液滴上，使细胞与 DAPI 染色试剂接触。

最后，在配备 DAPI 滤光片的荧光显微镜下观察染色后的细胞。图中展示了三种细胞死亡模式下的核形态。可见凋亡细胞的细胞核发生凝聚。

在经历有丝分裂灾难的细胞核中可观察到多个叶状结构。经历衰老的细胞显示出典型的与衰老相关的异染色质灶。图中展示了假照射手段处理的细胞核与接受6 Gy X射线照射的细胞核的对比观察结果。

圆圈表示正在经历凋亡的细胞核，箭头表示正在经历有丝分裂灾难的细胞核。图中显示了约300个经照射处理与对照组细胞核的评估结果。6 Gy X射线照射导致有丝分裂灾难的发生率约为25%，凋亡的发生率约为5%，而衰老事件极为罕见。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在一小时内完成。在进行此操作时，需注意避免将溶液直接施加于盖玻片上而损伤细胞。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，如流式细胞术分析或细胞死亡标志物蛋白检测，以及衰老相关β-半乳糖苷酶染色以评估细胞衰老情况，从而更深入地理解克隆形成性细胞死亡的每一种模式。