小鼠发育期垂体的分离与冠状切片制备

本实验的主要目标是从发育中的小鼠获取组织结构保存良好的垂体冠状切片。该方法有助于回答垂体发育领域的关键问题，例如垂体组织学、细胞分化、增殖以及凋亡等。该技术的主要优势在于，能够在无明显损伤的情况下分离发育期小鼠的垂体，并进行准确的定位，以获得理想的冠状切片。

我们最初想到这种方法是因为在获取发育中鼠类垂体的适当冠状切面时遇到了技术上的困难。按照文本方案麻醉并固定小鼠后，使用剪刀剪开颅骨。接着，用镊子从颅底轻轻提起后脑。

然后，在首次观察到蝶鞍结构时，停止向上提拉，但继续固定后脑，使用精细剪刀切断连接于脑基底部的垂体柄及神经纤维。继续提拉并取出整个脑组织，以充分暴露垂体。垂体位于蝶骨背侧表面，外侧由三叉神经环绕。

然后使用剪刀剪下整个鞍区，包括垂体、三叉神经外侧支以及蝶骨下方的组织。将组织放入含有4%PFA的35 mm培养皿中，根据样本年龄在4摄氏度下孵育40分钟至3小时。随后用10 mL PBS清洗固定后的组织，每隔15分钟换液一次，共更换五次。

将固定好的组织转移至含有1 mL PBS的35 mm培养皿中，在体视显微镜下分离垂体。对于P5至P14阶段的垂体，使用精细镊子和剪刀去除神经与骨骼之间的结缔膜，并将垂体连同外侧三叉神经整体小心分离，但保留蝶鞍结构。对于P21及成年垂体，则需去除垂体周围的神经和结缔膜，将腺体从周围组织中完全游离出来。

根据文本方案完成脱水、二甲苯透明和石蜡浸润后，在组织包埋台系统上，将标本从包埋盒中取出，并置于已半充满熔融石蜡的底模中。对于 P21 和成年垂体组织，使用预热的精细镊子将垂体短轴垂直于底模底面进行定位。对于 P0 至 P4 期垂体组织，应将标本以其蝶骨垂直于底模底面的方向进行摆放。

对于P5至P14期的垂体组织，将样本的三叉神经垂直于底模的底面进行定位。放置腺体后，使用预热的精细镊子轻轻固定组织于理想位置，直至在冷却板上石蜡变为半固态。随后用熔融的石蜡填充模具。

让石蜡包埋块冷却至石蜡完全凝固。将石蜡包埋块在零下20摄氏度条件下冷冻10至20分钟，然后使用切片机将其切成薄片，并在切片过程中精细调整石蜡包埋块的位置。按照文本方案进行免疫标记。

如图所示，从新生小鼠中分离垂体时，需从颅底取出包含垂体、三叉神经以及其下方蝶骨在内的整个蝶鞍区域。在此过程中，微小而精细的垂体保持完整。对于出生超过五天的小鼠，则分离与侧支三叉神经相连的垂体。

从P7小鼠中分离出的垂体腺生长结构保存良好。此处，在去除周围组织时，成功分离了P21小鼠的垂体腺，且未见明显损伤。在本图中，经过适当定向的冠状切片进行H&E染色，显示P0、P7和P21小鼠垂体腺的腺垂体和神经垂体均具有保存良好的形态。

最后，处理好的切片也可用于免疫荧光标记。例如，腺垂体和神经垂体分别显示出 GH 和 GFAP 的特异性免疫标记。一旦掌握该技术，从成年小鼠的解剖到包埋的过程可在 7.5 小时内完成，若操作得当，幼龄小鼠所需时间更短。

进行此操作时，重要的是要记住完整解剖整个鞍区，以避免任何手术器械接触垂体。完成此操作后，未经过预固定的垂体也可被分离。在这种情况下，应更加小心谨慎，以避免造成任何不必要的损伤。

应尽快完成腺体的解剖。观看本视频后，您应能够充分掌握如何解剖小鼠垂体并制备不同发育阶段的垂体冠状切片。